La notion de biodisponibilité

Avant de procéder à la préparation de l’échantillon à proprement parlé, il est intéressant de s’interroger sur la biodisponibilité des molécules. Le terme de biodisponibilité est défini comme la fraction accessible d'un produit chimique qui est assimilable et potentiellement toxique (Alexander, 2000). Cette notion est le plus souvent évoquée lors du traitement d’échantillon sédimentaire (Harmsen, 2007; Brack et al. 2009; Bandow, 2011; Brack et al., 2011a). Ce dernier, de par, sa composition (i.e. eau interstitielle, phase minérale, phase organique), peut renfermer des composés organiques qui peuvent ou non être bio-accessibles pour les organismes. La notion de biodisponibilité peut être également appliquée à un échantillon prélevé dans la colonne d’eau. Dans ce compartiment, la biodisponibilité est liée à la présence de différents composants, matières organiques dissoutes (MOD) et particulaires (MOP). Le concept de biodisponibilité peut être résumé en trois phases (Figure 12).

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Figure 12 : Principe de la biodisponibilité (Harmsen, 2007).

La première étape correspond à la disponibilité du contaminant dans l’environnement. Ensuite vient la seconde phase qui est l’absorption du polluant par l’organisme. Finalement, la troisième étape correspond aux mécanismes que provoque le contaminant à l’intérieur de l’individu. (Harmsen, 2007). Lors de suivis environnementaux sur le milieu, la fraction bio-disponible est caractérisée comme la fraction désorbable et dissoute qui est accessible aux organismes (Seiler et al., 2008). Dans le cadre de l’approche EDA, il est primordial d’avoir à l’esprit ce concept et d’essayer de mimer au maximum lors de la préparation d’échantillon, les conditions présentes dans l’environnement afin de connaître les composés bio-disponibles. Sinon, il peut y avoir une surestimation du risque environnemental. Plusieurs études ont rapporté cette possibilité lors d’études sur des sédiments et ont montré que la présence de composés hydrophobes menait à l’observation d’une toxicité élevée, mais ces molécules n’étant pas bio-disponibles in situ, le danger environnemental était faible (Bandow et al., 2009b; Brack et al., 2009). Une alternative récemment proposée, pour prendre en considération cette notion est non plus de rechercher les composés dans la matrice environnementale à étudier mais de détecter directement dans les organismes exposés les molécules assimilées (Brack et Burgess, 2011; Eichbaum et al., 2013).

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4.2.2 L’extraction

Dans un échantillon, la présence de différents éléments (e.g. minéraux, sels, pigments…) autres que les contaminants organiques à rechercher peuvent entraîner des problèmes analytiques aussi bien pour l’analyse chimique que biologique. Par conséquent, les composés organiques présents dans l’échantillon doivent être extraits de la matrice contenant les interférants. Le processus d’extraction des contaminants organiques doit être le plus exhaustif possible afin de représenter au mieux la contamination réelle de la matrice. L’extraction repose sur les propriétés physico-chimiques des composés et de la matrice étudiée. Elle se base généralement sur le principe de l’affinité molécules/substrat.

a. Les techniques conventionnelles

Les méthodes d’extraction appliquée sur les matrices solides (e.g. sédiments, boues de station d’épuration (STEP)…) ou bien liquides (e.g. eau de rivière, effluent de STEP, lixiviat…) sont nombreuses. Tout comme pour le choix des bio-essais lors de l’approche EDA, elles doivent être efficaces, rapides et peu coûteuses. Les extractions les plus appliquées dans la démarche EDA sont celles employées en routine dans les analyses chimiques.

Dans le cas de matrices solides, l’extraction de Soxhlet fait partie des techniques souvent utilisées (Otte et al., 2013). Cette méthode non automatisée possède quelques inconvénients. L’un des inconvénients non négligeable de cette méthode est la nécessité de porter l’extrait à haute température ce qui peut entraîner la dégradation des composés thermolabiles. L’utilisation d’une forte quantité de solvant peut poser un problème éthique sur le plan environnemental et rend cette technique coûteuse. Des méthodes pouvant être qualifiées de plus douce en terme de température et moins consommatrices en solvant sont utilisées dans l’approche EDA. L’extraction en phase liquide haute pression (Pressurized

Liquid Extraction, PLE ; Accelerated Solvent Extraction, ASE^®) est l’une des plus appliquées. Cette technique est reconnue pour être rapide et efficace. Généralement, elle est optimisée pour des familles de composés afin d’obtenir des bons rendements d’extraction. Creusot a montré qu’il était également possible de mettre en place une méthode d’extraction multi-classes (i.e. stéroïdes, composés pharmaceutiques, AKP, HAP, PCB, dioxine) permettant d’extraire de manière quasi-exhaustive des molécules aux propriétés physico-chimiques variées grâce à l’emploi de solvants de différentes polarités, du moins polaire comme l’hexane ou le cyclohexane, aux plus polaires comme le méthanol et l’éthanol. Les rendements obtenus lors des développements sont compris entre 68 % et 144 % (Creusot, 2011). De plus, cette technique est automatisée ce qui lui confère un avantage supplémentaire non négligeable et permet le traitement de plusieurs échantillons dans une même série. L’extraction par micro-ondes (Microwave-Assisted Extraction) possède également ces caractéristiques et est par conséquent retrouvée dans la bibliographie (Bartolomé et al., 2005; Schulze et al., 2012). Cette dernière peut également être appliquée sur la matière organique particulaire lors de prélèvement de matrices liquides. Une autre méthode simple et peu coûteuse qui est employée dans la préparation d’échantillon pour l’approche EDA, est

40 l’extraction par sonication (Giltrap et al., 2009). Cependant, ces deux dernières techniques nécessitent une étape supplémentaire de filtration ou de centrifugation afin d’éliminer les résidus de matrices présents dans l’extrait.

Pour les matrices liquides et plus précisément la phase dissoute, l’extraction liquide/liquide est rarement rencontrée dans les approches EDA (Lukasewycz et Durhan, 1992). La méthode principalement utilisée dans la littérature est l’extraction sur phase solide (Lukasewycz et Durhan, 1992; Thomas et al., 2002b; Farré et Barceló, 2003). Ces méthodes font appel à une multitude de solvants d’extraction et l’utilisation en mélange permet de balayer toute la gamme de polarité. L’utilisation de différents solvants permet d’extraire une large gamme de composés aux propriétés physico-chimiques variées (e.g. composés pharmaceutiques, pesticides, stéroïdes, HAP…).

b. Les techniques accès sur la biodisponibilité

- L’extraction dirigée par la bio-accessibilité

Outre ces extractions conventionnelles, de plus en plus d’auteurs font appel à des méthodes liant l’extraction à la notion de biodisponibilité. Dans le cas de la préparation de sédiment, il est possible d’identifier deux types d’approches : les techniques se basant sur l’extraction de la fraction bio-accessible de l’échantillon (Bioaccessibility-directed extraction, BDE) comme l’extraction par cyclodextrines, TENAX®

ou l’extraction par fluide supercritique ; et celles qui essayent de mimer les procédés de désorption pouvant se créer dans le système digestif des organismes (e.g. l’extraction avec des fluides biologiques ou biomimétiques) (Brack et Burgess, 2011). La majorité de ces méthodes ne sont pas actuellement employées comme techniques d’extraction dans la démarche EDA. Elles sont généralement trop coûteuses et ne permettent pas d’extraire une quantité suffisante d’échantillon pour effectuer toutes les étapes de l’approche. Seule la méthode d’extraction TENAX^® est retrouvée associée à la démarche EDA (Schwab et al., 2009). Le TENAX^® est un polymère poreux synthétisé à partir de l'oxyde de 2,6-diphényl-p-phénylène qui est utilisé pour piéger les composés hydrophobes facilement désorbables. La méthode est simple. Elle consiste à placer la résine en présence du sédiment à extraire et de l’eau ; le tout est mis à agiter pendant plusieurs heure (6 h à 30 h) (Cornelissen et al., 2001). La membrane est ensuite extraite par l’utilisation de solvant puis l’extrait est analysé. Schwab et Brack (2007) ont optimisé cette technique d’extraction afin de pouvoir extraire une plus grande quantité d’échantillon et ainsi l’appliquer à l’approche EDA. Mais cette méthode d’extraction reste relativement longue même après leur développement ; le temps d’exposition du polymère reste de 24 h. Schwab et al. (2009) ont montré l’utilité d’employer une telle technique pour mettre en évidence la présence de plusieurs HAP désorbables de leur matrice sédimentaire et par conséquent bio-disponibles pour les organismes benthiques. D’autres auteurs ont démontré que la fraction bio-accessible obtenue par cette technique d’extraction correspondait

41 à la fraction bio-accumulée par les organismes benthiques (e.g. Oligochaete) (Ten Hulscher et al., 2003).

- L’extraction basée sur le partitionnement

Une autre approche prend en compte ces phénomènes, l’extraction basée sur le partitionnement (Partition-Based Extraction, PBE). La PBE se base sur le piégeage passif des molécules dissoutes libres qui circulent entre les différents compartiments. Pour permettre la mise en place d’une telle extraction, des dispositifs d’échantillonnage passif ont été développés par la communauté scientifique pour des études autres que celles utilisant l’approche EDA. Le principe repose sur le transfert de composés du milieu vers la phase réceptrice (i.e. le transfert de masse). La phase réceptrice peut être sous forme de solvant, réactif chimique ou phase adsorbante poreuse (Namieśnik et al., 2005). La méthode par microextraction en phase solide (Solid Phase MicroExtraction, SPME) peut être considérée comme une technique d’échantillonnage passif puisqu’elle repose sur l’équilibre de diffusion entre la matrice environnementale et la fibre d’extraction (Lord et Pawliszyn, 2000). Cette méthode, rapide et ne demandant pas de solvant, permet de renseigner sur la présence de composés potentiellement bio-accumulables (Bakker et al., 2007). La diversité des fibres disponibles dans le commerce permet d’extraire une large gamme de composés. Un de ces atouts réside dans le fait que l’échantillonnage peut être pratiqué en simultané avec une exposition des organismes (You et al., 2011). Actuellement aucune étude n’a référencé le couplage SPME et approche EDA. Néanmoins, Bakker et al., (2007) précisent son utilité en tant que méthode complémentaire à l’approche EDA pour fournir des informations sur la réponse biologique de la matrice mais aussi pour quantifier les molécules potentiellement bioaccumulables.

Aujourd’hui, la diversité des techniques d’échantillonnage est telle qu’elle permet de balayer une large gamme de polarité et donc de cibler différentes familles de composés (Tableau 5). La multitude d’échantillonneurs passifs permettent appliquer ces techniques pour extraire les composés dans des matrices aqueuses ou au contact du sédiment au niveau de l’eau interstitielle contenue dans la matrice solide (e.g. SPMD). Ces dispositifs peuvent être directement déployés sur le terrain et échantillonnent par conséquent le milieu. Suivant le type d’échantillonneur utilisé, le temps de séjour sur le terrain peut varier de quelques minutes à plusieurs mois (Vrana et al., 2005). Les avantages de ce type de méthodes quel que soit le type d’échantillonneur sont nombreux.

L’échantillonnage passif simplifie les étapes de préparation. Lors des déploiements sur le terrain, il reste exposé durant une période de temps relativement longue intégrant par conséquent de manière continue la concentration dans le milieu qui peut être affectée par les conditions environnementales (Belles, 2012; Wund, 2013). En moyennant la concentration (Time Weigh Average, TWA), certains de ces dispositifs sont qualifiés d’intégratif (e.g. POCIS). Le temps d’exposition permet également d’accumuler des composés et donc de

42 pouvoir par la suite détecter des molécules à l’état de traces qui seraient non détectables par l’échantillonnage ponctuel. L’intérêt est que certaines molécules peuvent entraîner une réponse biologique à des concentrations extrêmement basses qui sont en-deçà des limites de détection obtenues par les méthodes classiques ; l’échantillonnage passif permet de pouvoir détecter ces composés actifs.

L’autre intérêt de ces dispositifs est qu’ils miment la biodisponibilité des contaminants. Ils ont été conçu pour imiter le transfert à travers la membrane biologique et donc la bioaccumulation de composés dans les tissues. Les SPMD sont constitués de lipides, la trioléine, piégés entre deux membranes en polyéthylène de faible densité (Low Density

PolyEthylene, LDPE ; Figure 13). Des pores transitoires d’une taille inférieure à 10 Å sont

créés par les mouvements thermiques existant au sein des membranes en polymère. Ces cavités permettent la circulation de molécules de poids moléculaire inférieur ou égal à 600 Da (Huckins and Alvarez, 2004). Ces caractéristiques ont été développées afin de mimer les membranes de phospholipides de l’épithéliale branchial chez le poisson ce qui confère à cet échantillonneur passif la capacité de capter seulement les molécules hydrophobes bio-disponibles, rendant ce dispositif intéressant pour le couplage avec l’approche EDA ( Sabaliūnas et al., 1999; Lu and Wang, 2003; Rastall et al., 2006). D’autres échantillonneurs passifs tels que les POCIS possèdent également des membranes qui servent de barrières physiques pour limiter le transfert de macromolécules mais ne permettent pas une sélection de taille aussi drastique afin d’imiter les barrières biologiques.

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44 Cependant, ces échantillonneurs restent des outils intégratifs et pertinents pour l’échantillonnage de la phase dissoute et de récentes études montrent que son couplage avec l’approche EDA est un outil prometteur pour la détection de polluant émergent dans les milieux aquatiques (Creusot et al., 2014; Liscio et al., 2014).

Une autre approche semblable à la PBE est le dosage basé sur le partitionnement (Partition Based-Dosing, PBD). Comme pour la PBE, cette méthode tient compte de l’équilibre existant entre les différents compartiments. L’extraction consiste, dans ce cas à travailler, directement sur les organismes vivants en les exposant à une membrane ayant absorbée les composés de la matrice à étudier (e.g. SPMD, LDPE…) (Bandow et al., 2009a). Cette méthode est employée pour identifier des composés toxiques. Son couplage avec l’approche EDA pour étudier des échantillons de sédiments, a permis de mettre en évidence la toxicité, sur des algues vertes Scenedesmus vacuolatus, de différents composés comme les HAP qui était déjà connue mais aussi, de molécules de synthèse présentes dans les produits de soins corporels comme le triclosan et l’hexadécanol (Bandow et al., 2009b).

Figure 13 : Conception d’un échantillonneur passif de type SPMD (Semi-permeable Membrane Device) (Huckins et Alvarez, 2004).

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4.2.3 Le fractionnement

Le fractionnement de l’échantillon est l’essence même de l’approche EDA. C’est l’étape sur laquelle est fondée la démarche. L’idée est de séparer les composés présents dans la matrice environnementale généralement très complexe afin de sélectionner seulement les molécules entraînant une réponse biologique. L’extraction de l’échantillon peut être déjà considérée comme la première étape de fractionnement (Brack et al., 2011a) En effet, elle permet comme énoncé précédemment de séparer les composés présents des autres éléments pouvant interférer durant les tests biologiques et les analyses chimiques (e.g. acide humique, pigments, lipides…). Tout comme lors de l’étape d’extraction, le fractionnement se doit d’être le plus exhaustif possible, c’est-à-dire que le processus de fractionnement doit être optimisé afin qu’il y est le minimum de pertes en composés. Il ne doit pas non plus apporter de composés supplémentaires susceptibles d’entrainer une réponse biologique. Généralement afin de vérifier l’absence de contamination, des blancs de procédure sont effectués en parallèle de la préparation de l’échantillon (Bakker et al., 2007; Weller, 2012). Le fractionnement consiste à séparer des composés, en se basant sur les interactions non-spécifiques liées à la force de Van der Waals (i.e. force électromagnétique de faible intensité s’exerçant entre les atomes ou les molécules) et les interactions spécifiques résultant de structures moléculaires particulières (Brack et al., 2011b). Le fractionnement fait appel à la chromatographie et la plus rencontrée est celle en phase liquide. Il existe une grande diversité de procédures de fractionnement (Tableau 1, p22). Cette multitude de techniques permet d’appréhender des natures de matrices environnementales variées qui renferment des composés aux propriétés physico-chimiques diverses. En plus du fractionnement par chromatographie d’exclusion stérique, il est possible de distinguer grossièrement de type de fractionnement. Le fractionnement en phase normale (NP, e.g. cyanopropyle, silice…) est adapté aux molécules apolaires, plutôt hydrophobes, se retrouvant préférentiellement dans les matrices solides (e.g. sédiment, boue…). Alors que le fractionnement en phase inverse (RP) est plus approprié aux composés plus polaires, hydrophiles, se localisant, dans la phase dissoute.

Le Tableau 1 (p22) illustre le fait qu’il n’existe pas une méthodologie universelle et montre que le fractionnement suivant les études peut être plus ou moins poussé. Dans la littérature, de nombreux auteurs ont choisi de réaliser plusieurs processus de fractionnement. Après chaque étape de séparation, le profil biologique de l’ensemble des fractions est établi. Il est ainsi fréquent de combiner plusieurs méthodologies de fractionnement. Par exemple, Brack et al couplent dans différentes études, le fractionnement en phase solide sur colonne d’alumine, la chromatographie en phase liquide en phase normale puis la chromatographie en phase inverse et peuvent ajouter la chromatographie d’exclusion stérique (Brack et al., 2003; Brack et Schirmer, 2003). Ce type de démarche permettant de séparer très finement l’extrait est fastidieux et entraîne inévitablement la perte de molécules et potentiellement

46 d’informations sur d’éventuels effets de mélange. Afin de rendre le fractionnement multiple plus rapide, une méthode automatisée en phase normale a été développée (Lübcke-von Varel et al., 2008). Cette méthode a été appliquée avec succès dans différentes études pour l’identification de composés apolaires dans des matrices sédimentaires (Kaisarevic et al., 2009; Lübcke-von Varel et al., 2012). Le fractionnement par chromatographie en phase gazeuse a également été développé mais son application est moins courante. Son principe est simple : les composés séparés et sortant de la colonne chromatographique sont piégés dans un solvant à basse température (e.g. dichlorométhane, -10°C) (Meinert et al., 2007; Meinert et al., 2010). Cette technique nécessite de disposer de système de refroidissement sophistiqué. Meinert et al. ont utilisé ce type de fractionnement en complément d’un fractionnement en phase liquide qui n’était pas assez séparatif pour identifier des composés mutagènes dans des eaux souterraines (Meinert et al., 2010). Récemment, Pieke et al., (2013) ont développé un autre type de fractionnement par chromatographie en phase gazeuse quasiment automatisé. Le système consiste à injecter en sortie de colonne chromatographique, après avoir préalablement refroidi le capillaire, un solvant afin de solubiliser les composés volatils puis de collecter l’éluat. Les fractions sont directement déposées dans des plaques 96 puits pour réaliser les tests biologiques (test DR-LUC), juste après la fin du fractionnement. Lorsque les fractions ont été collectées, elles sont évaporées et les cellules sont ajoutées en suivant dans les puits. Le temps de rétention permet de remonter directement aux composés présents dans les fractions actives. Cette technique a été appliquée avec succès sur des molécules étalons tels que les HAP et sur un échantillon de référence certifié contaminé en HAP. L’un des inconvénients non négligeable de ce fractionnement en phase gazeuse est la faible quantité d’échantillon introduite dans le système, nécessitant donc la répétition des injections. L’autre difficulté réside dans le solvant utilisé en sortie de colonne (Pieke et al., 2013). Ce dernier ne doit pas s’évaporer trop rapidement et doit être compatible les tests biologiques effectués en aval. Cette méthode ouvre des nouvelles perspectives en termes de fractionnement mais son efficacité reste à démontrer sur d’autres échantillons environnementaux.

Quelle que soit la méthode de fractionnement employée, la collecte de fractions peut s’effectuer de manière manuelle ou automatique. Bien évidemment, les techniques automatiques rendent cette étape moins fastidieuse et contraignante. Les développements actuels sont donc tournés vers l’automatisation totale de cette étape de fractionnement qui englobe la séparation des composés, l’évaluation de la réponse biologique des fractions et l’identification. Les efforts de recherche sont ciblés sur le développement de méthodes rapides et efficaces, adaptées à l’échantillon afin d’éviter la perte de molécules par les procédés de préparation.