Assurance qualité lors des analyses chimiques

De façon à fournir des résultats analytiques fiables et robustes, chaque instrument analytique est vérifié avant chaque utilisation et plusieurs éléments sont contrôlés avant et pendant l’acquisition des données. La résolution et la calibration des spectromètres de masses sont vérifiées par l’infusion d’une solution de calibration spécifique à chaque appareil fournie par le fabriquant. Les limites de détection et de quantification des composés recherchés et la répétabilité des analyses font l’objet d’un suivi régulier. Pour éviter la présence d’interférents lors des analyses, les bouteilles de solvant employées pour la phase mobile sont neuves et de qualité HPLC. L’eau ultra-pure est fraîchement préparée par un système de purification équipé d’un filtre EDS-PAK et l’acide formique à 99% est contenu dans des ampoules individuelles de 1 mL (Chapitre 3, §3, p 78). Pour éviter toute contamination croisée, du solvant (i.e. “blancs d’injection”) est injecté entre chaque injection d’échantillons tout au long de la séquence d’acquisition. Pour contrôler l’absence d’une dérive instrumentale, une solution standard, contenant les composés à doser et leur étalon interne pour les analyses chimiques ciblées ou des molécules connues pour les analyses chimiques non ciblées, est injectée régulièrement durant la séquence

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6.1.1 Généralités

Les analyses de molécules ciblées ont été menées sur des fractions ou des extraits d’échantillon globaux. Elles permettent d’obtenir une détection rapide des composés présents à des concentrations relativement faibles. Elles sont généralement réalisées lorsque la présence d’un composé ou d’une famille de composés, pouvant expliquer les effets biologiques observés, est supposée. Pour les fractions obtenues par HPLC, l’hypothèse de la présence de telle ou telles molécules est annoncée en se basant sur le chromatogramme de la solution de référence (en phase inverse ou phase normale) constituée de plusieurs molécules (Chapitre 4, section 2.1, p 114). Ce chromatogramme est permet de connaître l’élution et la collecte de certains composés suivant les fractions.

Les techniques de séparation sont sélectionnées suivant les propriétés physico-chimiques des composés recherchés. Ainsi, les analyses des composés volatils ou volatilisables sont réalisées par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse simple ou en tandem (GC-MS, GC-MS/MS) ou à un détecteur à capture d’électrons (GC-ECD). L’analyse des molécules plutôt polaires est effectuée par chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS) avec une source d’ionisation par nébulisation (ESI). Les analyses par GC-MS et GC-ECD permettent d’identifier les molécules par rapport à leurs temps de rétention. Les instruments utilisant la spectrométrie de masse en tandem possèdent trois quadrupôles (QqQ) et sont utilisés en mode MRM (Multiple Reaction Monitoring), excepté l’analyse en GC-MS/MS pour les HAP. Par cette technique, quatre critères sont contrôlés pour permettre une identification fiable des composés :

i. Le temps de rétention de l’analyte ii. La transition de quantification iii. La transition de confirmation

iv. Le rapport de l’intensité entre ces deux transitions

La quantification des composés étudiés est faite soit par étalonnage interne, soit pour quelques molécules par étalonnage externe. Pour la méthode d’étalonnage interne, les fractions ou extraits à injecter sont suplémentés avant l’analyse par une quantité connue en composés isotopiquement marqués (i.e. les étalons internes). Ces étalons doivent être initialement absents de l’échantillon et doivent posséder des propriétés physico-chimiques très proches de l’analyte afin d’avoir un comportement similaire au cours de l’analyse.

Des analyses sur différentes familles de composés ont été effectuées pour la détection de molécules connues. Toutes les méthodes d’analyse et les composés recherchés sont listés dans les paragraphes suivants.

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6.1.2 Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)

Les HAP sont analysés par GC-MS (GC série 6890 et détecteur, série 5973, Agilent technologies, Waghaeusel, Germany) et GC-MS/MS (GC série 7890, QqQ série 7000 B, Agilent technologies, Waghaeusel, Germany) en mode SIM (Single Ion Monitoring). L’analyse par GC-MS/MS est réservée aux fractions non analysables par spectrométrie de masse simple (e.g. effets matriciels trop importants masquant les composés) ou aux fractions ayant des HAP en concentration faible. Les conditions analytiques et les limites de quantification des composés obtenues par ces méthodes d’analyse sont présentées Annexe II.

6.1.3 Polluants organiques persistants

Les polluants organiques persistants (POP) (i.e. polychlorobiphényles, PCB, polybromodiphényléthers, PBDE et pesticides organochlorés, OCP) sont analysés par GC-ECD pour l’analyse des lisiers porcins et pour les boues de STEP. Plusieurs GC-GC-ECD sont disponibles au laboratoire EPOC-LPTC, deux instruments analytiques ont été utilisés sur ces études :

 Un système de chromatographie en phase gazeuse (série G 1530 A, Agilent technologies) couplé avec un détecteur à capture d’électrons (série G 2397 A, Agilent technologies).

 Un système de chromatographie en phase gazeuse plus récent (série G 1530 N, Agilent technologies) couplé avec un détecteur à capture d’électrons (série G 2397 A, Agilent technologies)

Le choix de l’appareil dépend de sa disponibilité. Les conditions analytiques et les les limites instrumentales des composés obtenues par ces méthodes d’analyse sont présentées Annexe III.

6.1.4 Médicaments

Les médicaments sont analysés par LC-MS/MS (chaine HPLC série 1200, QqQ serie 6410, Agilent technologies, Santa Clara, USA). Les conditions analytiques et les limites instrumentales de quantification des composés obtenues par la méthode d’analyse sont présentées Annexe IV. Les paramètres de détection (e.g. ions fragments, tension de fragmentor, énergie de collision…) sont détaillés dans la thèse de Marion-Justine Capdeville (2011).

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6.1.5 Stéroïdes

Les stéroïdes sont analysés par LC-MS/MS sur une chaine UPLC Acquity Waters (Ultra Performance Liquid Chromatography) couplé à un spectromètre de masse à triple quadrupôle Quattro Premier XE triple quadrupôle (Waters, Guyancourt, France). Pour une meilleur sensibilité, les œstrogènes sont analysés sur une chaine HPLC 1290 Infinity Agilent Technologies couplée à un spectromètre de masse en tandem Agilent Technologies série 6490.

Les conditions analytiques et les paramètres de détection des appareils optimisés pour chaque composé sont présentés en Annexe V. Les limites instrumentales de quantification des composés obtenues par les méthodes d’analyse sont données Annexe V.

6.1.6 Pesticides

Les pesticides sont analysés par LC-MS/MS (chaine HPLC série 1290, QqQ série 6460, Agilent technologies, Santa Clara, USA). Les conditions analytiques et les limites instrumentales de quantification des composés obtenues par la méthode d’analyse sont présentées Annexe VI. Les paramètres de détection (e.g. ions fragments, tension de fragmentor, énergie de collision…) sont détaillés dans la thèse de Angel Belles (2012).