La conservation de l’échantillon

Dès leur arrivée au laboratoire, les échantillons doivent être conservés dans l’attente de leur extraction. La conservation s’effectue à -20°C. Cependant, des questionnements sur le matériel de stockage et sur la filtration de l’échantillon se sont posés pour la conservation des activités biologiques.

1.2.1 La filtration

L’influence de la filtration sur l’activité œstrogénique des échantillons d’eaux provenant des deux STEP a été évaluée. Les échantillons d’eaux usées brutes et traitées prélevées sur un jour pour les STEP de Biganos et de Clos de Hilde ont été filtrés avant leur stockage à -20°C ou après le stockage, c’est-à-dire juste avant leur extraction. Les échantillons ont été filtrés sur filtres GFF (0,7 µm) préalablement calcinés à 450°C pendant 6h. Les échantillons sont conservés dans du polyéthylène haute densité. Les filtrats ont ensuite été extraits par SPE selon le protocole exposé en section 4.3.2 du Chapitre 3 (p 82). Les extraits ont été testés biologiquement sur la lignée cellulaire HELN-ERα à l’INSERM.

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Figure 26 : Activité œstrogénique mesurée dans les extraits d’eaux usées brutes (A) et traitées (B) issues des STEP de Clos de Hilde et de Biganos en suivant deux procédures de filtration : filtrée avant ou après le stockage par congélation à -20°C. Les échantillons ont été conservés dans du polyéthylène haute densité. L’activité est exprimée en ngE2-EQ/L. Les extraits ont été déposés sur les cellules HELN-ERα en triplicat (n=3 puits). Les barres d’erreurs représentent une marge d’erreur théorique de 5%.

Suivant les stations et le type d’échantillon, c’est-à-dire eaux usées brutes ou traitées, le moment de la filtration à une influence sur l’activité œstrogénique mesurée (Figure 26). Pour l’eau usée brute de la STEP de Biganos et l’eau traitée de la station de Clos de Hilde, les réponses biologiques sont moins intenses quand l’échantillon est filtré après congélation, juste avant l’extraction. Par contre pour l’eau traitée de Biganos ou l’eau brute de Clos de Hilde, la filtration avant ou après congélation ne semble pas impacter l’activité œstrogénique. Aucune tendance générale ne peut être dégagée des résultats obtenus.

Le moment de la filtration peut ou non avoir une influence sur les activités biologiques des échantillons mais cet impact est dépendant de la composition de l’échantillon. Ce test ne peut être effectué systématiquement lors de criblages de plusieurs échantillons. Par conséquent, pour des raisons pratiques, il a été choisi de filtrer l’échantillon d’eaux dès l’arrivée au laboratoire, c’est-à-dire avant le stockage à -20°C.

1.2.2 Le matériel de conservation de l’échantillon

Suivant les propriétés physico-chimiques des molécules, des phénomènes adsorptions peuvent être observés dans les échantillons prélevés et stockés dans du verre ou du polyéthylène haute densité. Il est apparu intéressant d’évaluer l’influence du matériel dans lequel est conservé l’échantillon sur les composés actifs et par conséquent sur l’activité biologique. La station d’épuration de Clos de Hilde a été prélevée durant trois jours successifs en entrée et sortie de traitement (Janvier 2013). Les prélèvements ont été moyennés sur un jour. Les échantillons ont été filtrés sur filtre GFF (0,7 µm) puis transférés dans des bouteilles

107 en verre ou en polyéthylène haute densité avant stockage à -20°C. Les filtrats ont ensuite été extraitS par SPE selon le protocole exposé en section 4.3.2 du Chapitre 3 (p 82). Les activités œstrogéniques et androgéniques des extraits ont été évaluées sur les lignées cellulaires MELN et MDA-kb2, respectivement.

Les résultats de l’influence du matériel de stockage des échantillons sur les réponses œstrogéniques et androgéniques sont présentés en Figure 27. Pour tous les échantillons à l’exception de l’activité androgénique de l’eau traitée prélevée le jour 1, les filtrats conservés dans du verre possèdent des activités biologiques sensiblement supérieures aux échantillons stockés dans du polyéthylène. Néanmoins en tenant compte des barres d’erreurs, la tendance ne peut être confirmée statistiquement. Il peut donc être conclu que globalement, la conservation dans du verre ou dans du polyéthylène haute densité n’a pas une influence clairement marquée sur l’activité œstrogénique et androgénique pour les eaux de STEP.

Figure 27 : Activités œstrogéniques et androgéniques mesurées, dans les extraits d’eaux usées brutes et traitées issues de la station de Clos de Hilde prélevées sur 3 jours consécutifs, stockées dans des bouteilles en verre ou dans du polyéthylène haute densité (P-HD). Les activités sont exprimées en ng standard-EQ/L. Les extraits ont été déposés trois fois sur les cellules MELN pour le test ER et MDA-kb2 pour le test AR. Les barres d’erreurs correspondent aux écartypes (n=3).

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1.3 L’extraction

1.3.1 Choix de l’extraction

De manière à extraire le plus exhaustivement possible les molécules actives des échantillons d’eaux usées brutes et traitées de STEP, deux méthodes d’extraction ont été testées au cours de ces travaux, l’extraction SPE et l’extraction liquide/liquide (LLE). Les protocoles appliqués sont présentés dans la section 4.3.2 a et b du Chapitre 3 (p 82). Pour déterminer l’extraction la plus adaptée aux eaux de STEP, la station d’épuration de Clos de Hilde a été prélevée durant trois jours successifs en entrée et sortie de traitement (Janvier 2013). Les prélèvements ont été moyennés sur un jour. Une fois arrivés, les échantillons ont été filtrés sur filtre GFF (0,7 µm) puis stockés à -20°C. Les activités œstrogéniques et androgéniques des extraits ont été évaluées sur les lignées cellulaires MELN et MDA-kb2, respectivement.

Figure 28 : Courbes dose-réponses des extraits SPE et LLE d’eaux usées traitées issues de la station de Clos de Hilde prélevées sur 3 jours consécutifs, obtenues pour les activités œstrogéniques et androgéniques. Les extraits ont été exposés sur cellules MELN pour le test ER et MDA-kb2 pour le test AR.

La comparaison des réponses biologiques obtenues pour les échantillons d’eaux usées traitées extraites par SPE et par LLE montre que le protocole d’extraction sélectionné influe sur les activités œstrogéniques et androgéniques des eaux prélevées (Figure 28). Les réponses biologiques mesurées sont plus importantes lors de l’extraction par SPE que par LLE. Ce constat a également été observé sur les extraits d’eaux usées brutes. Ainsi l’extraction par SPE permet d’extraire plus de ligands œstrogéniques et androgéniques dans les échantillons prélevés. Par conséquent, la SPE a été privilégiée comme méthode d’extraction pour mesurer les activités biologiques dans les eaux de STEP.

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1.3.2 Validation des solvants d’élution

Après avoir validé la méthode d’extraction, l’élution des composés actifs a été optimisée. Trois protocoles d’extraction sur phase solide ont été testés utilisant les cartouches Oasis^® HLB. Le détail méthodologique est donné dans le Tableau 18. Le premier protocole (n°1) est basé sur l’étude réalisée par Bellet et al., (2012) pour évaluer les activités œstrogéniques et androgéniques d’eaux usées brutes de STEP. Le second (protocole n°2) est inspiré des développements méthodologiques effectuées par Wund (2013). L’élution choisie a permis d’extraire de façon quasi exhaustive plusieurs molécules aux propriétés physico-chimiques variées appartenant à différentes familles comme les pesticides, hormones, médicaments. Finalement, l’influence de l’acidification des eaux a été évaluée et constitue le protocole n°3.

Tableau 18 : Détails méthodologiques de chaque protocole testé.

Protocole n°1 n°2 n°3

Volume extrait 1L 250mL 250mL

pH Acidifié 3-5 - Acidifié 3-5

Cartouche Oasis® HLB Oasis® HLB Oasis® HLB

Elution 100% MeOH 100% MeOH 50/50 MeOH/CH₂Cl₂ 100% CH₂Cl₂ 100% MeOH 50/50 MeOH/CH₂Cl₂ 100% CH₂Cl₂ Reconcentration 200µL 500µL 500µL

Ces différents tests méthodologiques ont été réalisés sur les STEP de Biganos, Clos de Hilde et une STEP urbaine située dans l’Hérault, Brignac (capacité : 1 300 équivalent-habitants). Les extraits des eaux d’entrée et de sortie des deux STEP girondines ont été testés sur la lignée HELN-ERα afin d’évaluer l’influence du protocole sur l’activité œstrogénique. La réponse ER de la STEP de Brignac a été évaluée sur la lignée MELN.

Concernant les activités œstrogéniques des eaux usées brutes et traitées mesurées à l’aide de la lignée HELN-ERα, aucune différence marquée n’est observée entre les trois protocoles (Figure 29). Pour les STEP de Biganos et de Clos de Hilde, la procédure d’extraction sur phase solide n’influe pas sur la quantité de ligands ER élués. Quel que soit le protocole, l’activité œstrogénique est sensiblement la même.

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Figure 29 : Activités œstrogéniques mesurées dans les eaux d’entrée et de sortie des station de Biganos et Clos de Hilde soumises à différents protocoles d’extraction sur phase solide. L’élution est précisée entre parenthèses. Les activités sont obtenues sur la lignée cellulaire HELN-ERα.

Pour l’activité ER évaluée par la lignée cellulaire MELN, sur les eaux brutes et traitées de la STEP de Brignac, une différence significative est observée sur les protocoles testés (Figure 30). Le protocole n°2 utilisant l’élution constituée de méthanol et de dichlorométhane est plus adaptée pour extraire les ligands agonistes ER. Ce mode protocole d’extraction a donc été sélectionné pour l’extraction des molécules actives.

Figure 30 : Activités œstrogéniques mesurées dans les eaux d’entrée et de sortie de la station de Brignac soumises à différents protocoles d’extraction sur phase solide. L’élution est précisée entre parenthèses. Les activités sont obtenues sur la lignée cellulaire MELN.

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1.3.3 Influence de la déconjugaison

Dans certaines études notamment celles portant sur les stéroïdes, une étape de déconjugaison est effectuée en aval de l’extraction afin de déconjuguer les molécules possédant des groupements glucuronides ou sufatés ( Labadie et Budzinski, 2005; Gabet-Giraud et al., 2010; Bellet et al., 2012;). L’impact de la déconjugaison sur la mesure des activités biologiques a donc été évalué dans des eaux brutes et traitées de STEP au cours de cette thèse. Des échantillons d’eaux de la STEP de Clos de Hilde ont été prélevés sur un jour, filtrés sur filtres GFF (0,7 µm) puis extraits selon le protocole exposé en section 4.3.2 du chapitre 3 (p 82). Après élution, les solvants sont évaporés à sec sous flux d’argon et repris dans 5ml de tampon acétate (TA) à pH=5 conformément au protocole de Labadie et Budzinski, (2005). Une enzyme, la β-glucoronidase provenant Helix pomatia (≥100 000 units/mL, présence de sulfatase ≤7500units/mL en tant qu’activité secondaire), est alors ajoutée. L’extrait contenant l’enzyme est ensuite placé dans un incubateur à 55°C pendant 3h. Après l’incubation, l’extrait subit de nouveau le processus d’extraction SPE. Les activités œstrogéniques et androgéniques des extraits ont été évaluées sur les lignées cellulaires MELN et MDA-kb2, respectivement.

Figure 31 : Activités œstrogéniques (A) et androgéniques (B) obtenues dans les eaux d’entrée et de sortie de la station de Clos de Hilde avec et sans déconjugaison. Les extraits ont été exposés sur cellules MELN pour le test ER et MDA-kb2 pour le test AR. Les points représentent les valeurs obtenues pour chaque dépôt cellulaire (n=2 ou n=3).

112 L’évaluation des activités biologiques pour les extraits d’eaux de STEP montre qu’il existe une différence de réponses entre les échantillons déconjugués et ceux n’ayant pas eu d’étape de déconjugaison. Cependant, ce constat n’est valable uniquement pour l’eau prélevée en entrée de STEP (Figure 31). En effet, les composés véhiculés dans les eaux usées brutes sont excrétés en majorité par les urines et faeces sous forme conjugués. L’absence d’impact de la déconjugaison dans l’extrait d’eau traitée peut s’expliquer par le processus de traitement d’épuration des eaux en STEP qui fait appel à des microorganismes. Ces derniers peuvent donc décomplexer les molécules présentes(Ternes et al., 1999; Muller et al., 2008).

L’étape de déconjugaison n’a pas été incorporée dans le protocole final d’extraction des eaux de STEP. Son introduction est très complexe. L’étape augmente de façon non négligeable la préparation des échantillons. De plus, la déconjugaison n’a pas d’influence sur les effluents de STEP. Hors, ces derniers sont les plus intéressants pour l’évaluation du risque dans le milieu aquatique.

1.4 Conclusion

Les tests méthodologiques réalisés au cours de ces travaux de thèse se sont focalisés sur la préparation des échantillons de type liquide. Les développements ont été effectués sur le prélèvement, la filtration, la conservation et l’extraction des échantillons.

Une méthode de préparation a ainsi pu être mise en place. De nombreux éléments testés (filtration et matériel de stockage) n’ont pas montré d’influence significative sur les réponses biologiques testées (ER et AR) et des compromis pragmatiques ont donc été effectués. A contrario, l’extraction des échantillons impacte les activités biologiques mesurées. Ainsi il a été acté que les matrices liquides de type eaux de STEP devaient être extraites par extraction en phase solide.