Translocation du substrat

3.6.5.1 Sur le couplage du dépliement et de la translocation

Le mouvement de la chaîne polypeptidique depuis la base de la RP jusqu’à la chambre catalytique du 20S est évidemment une étape critique de la protéolyse. Il a été proposé que le dépliement et la translocation de la protéine soient des processus couplés où, après l’engagement d’une région peu structurée dans le pore du 20S, les domaines structurés sont

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séquentiellement dépliés de façon « mécanique » au fur et à mesure que les ATPases entraînent le substrat à travers le canal du complexe protéase (Lee et al, 2001; Prakash et al, 2004). La stabilité locale de la protéine détermine la quantité d’ATP hydrolysée et en conséquence la vitesse de dépliement et de translocation (Kenniston et al, 2003). Ce mécanisme coopératif est néanmoins remis en cause par certaines observations. Ainsi, alors que l’hydrolyse de l’ATP est nécessaire pour la dégradation d’une protéine globulaire par le complexe 20S-PAN, la dénaturation préalable de cette protéine rend l’hydrolyse de l’ATP dispensable pour sa translocation et sa dégradation (Smith et al, 2005). Une fois dénaturé, la translocation du substrat par PAN peut donc se faire par diffusion passive. De même, il a été montré chez les eucaryotes que le protéasome 26S dégrade des protéines natives intrinsèquement non-structurées (p21cip et la caséine) sans hydrolyse d’ATP, ces substrats atteignant la chambre protéolytique par diffusion passive à travers les pores du 20S ouverts par le 19S (Liu et al, 2006)12. Ces résultats suggèrent que la translocation (et l’étape de protéolyse) en tant que telle ne nécessite pas l’énergie d’hydrolyse de l’ATP. De plus, il a été montré que le dépliement de la GFP par le complexe PAN peut avoir lieu même en absence de translocation (Navon & Goldberg, 2001; Smith et al, 2005). Il apparaît donc que les processus de dénaturation et de translocation, au moins dans certains cas, sont parfaitement dissociables l’un de l’autre.

Le laboratoire de Goldberg a proposé que la translocation par diffusion passive soit rendue unidirectionnelle par la liaison du substrat aux sites catalytiques du 20S, qui empêche une diffusion rétrograde du polypeptide vers l’extérieur du 20S (Smith et al, 2006).

3.6.5.2 Orientation du substrat lors de la translocation

Un dernier point à éclaircir concerne l’orientation du polypeptide déplié, « linéarisé » lors de sa translocation dans le complexe protéolytique. Les études initiales ont suggéré un mode d’entrée prépondérant via une extrêmité du polypeptide (Pickart & Cohen, 2004). Par la suite, il est apparu que différents substrats entrent par des extrêmités différentes, soit N-terminale, soit C-terminale, ou indifféremment par les 2 (Prakash et al, 2004; Wolf & Hilt, 2004; Smith et al, 2006). Cette orientation semble liée à l’interaction du substrat avec les ATPases, le complexe 20S archébactérien seul ne présentant pas de préférence directionnelle (Navon & Goldberg, 2001).

Des protéines portant des pontages intramoléculaires sont dégradées par le protéasome, ce qui confirme que plusieurs chaînes polypeptidiques juxtaposées peuvent pénétrer dans le pore axial du 20S (Lee et al, 2002) ; de là à imaginer que la dégradation puisse être initiée à partir d’une boucle interne du substrat, il n’y a qu’un pas… franchit par Liu et al., qui ont montré qu’au sein d’un substrat artificiel composé d’un domaine non-replié (la protéine native non- structurée p21cip) entouré de 2 domaines stables (la protéine GFP), le domaine non-structuré est sélectivement dégradé par le protéasome (Liu et al, 2003). Enfin, cette possibilité d’un clivage endoprotéolytique par le protéasome, en lieu et place d’une dégradation totale, a permis d’expliquer certaines réactions inhabituelles de protéolyse partielle catalysées par le protéasome. Ce mécanisme, appelé RUP (Regulated Ubiquitin-Proteasome-dependent processing), est à l’origine de l’activation de plusieurs facteurs de transcription à partir de précurseurs inactifs (pour une revue, (Rape & Jentsch, 2004)). Le cas de la protétine p105,

12 _{Comme nous l’avons vu, ces protéines natives non-structurées peuvent également activer directement le 20S}

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précurseur de la sous-unité p50 du facteur de transcription NF-&B1, dont l’extrémité C- terminale est complètement dégradée par le protéasome alors que le domaine N-terminal p50 demeure intact, a été le premier cas décrit et reste l’un des plus célèbres (Hoppe et al, 2000).

3.6.5.3 Signal d’initiation de la protéolyse

La dégradation d’un substrat ne commence donc pas exclusivement à partir d’une extrêmité libre. De manière générale, la présence d’une région non-repliée sert de signal d’initiation (Prakash et al, 2004). Chez les bactéries, le motif de dégradation du substrat reconnu par les ATPases semble tenir ce rôle (Voges et al, 1999; Pickart & Cohen, 2004). Chez les eucaryotes, on constate au contraire un découplage entre le site de polyubiquitinylation du substrat et le site d’initiation de la dégradation : la direction de la dégradation n’est pas strictement déterminée par la localisation de la chaîne d’ubiquitine, et la dégradation ne commence pas nécessairement au niveau du site d’ubiquitinylation (Prakash et al, 2004). De plus, certaines protéines très structurées comme la GFP, même couplées à un tétramère d’ubiquitines, sont réfractaires à la dégradation (Liu et al, 2003). En fait, la chaîne d’ubiquitine est nécessaire mais non suffisante à la dégradation rapide d’une protéine repliée par le protéasome, la présence au sein du substrat d’une région non-structurée augmentant considérablement l’efficacité de sa dégradation (Prakash et al, 2004). En conclusion, la chaîne d’ubiquitine permet la reconnaissance des substrats par le protéasome, mais leur dégradation efficace requiert une région non-structurée additionnelle qui sert de signal d’initiation de la protéolyse (Prakash et al, 2004). L’absence d’une telle région pourrait expliquer la non- dégradation de certaines protéines polyubiquitinylées (Thrower et al, 2000). Des signaux contraires d’interruption de la dégradation ont également été identifiés, comme les séquences GRR (Glycine-Rich Repeat) séparant les domaines carboxy- et aminoterminal de p105 (Orian et al, 1995), ou les séquence répétées Glycine-Alanine de la protéine EBNA1 du virus Epstein-Barr qui bloquent sa dégradation par le protéasome, permettant ainsi aux cellules infectées d’échapper au système immunitaire (Dantuma & Masucci, 2002).