L’identification de PAC3 chez les mammifères (Hirano et al, 2006) et des homologues de PAC1 et PAC2 chez la levure (Li et al, 2007) a immédiatement précédé la soumission de nos résultats. Depuis, 3 articles ont également rapporté l’existence d’une paire Poc3-Poc4 de protéines chaperonnes participant à l’assemblage du protéasome 20S et confirmé nos résultats (Hoyt et al, 2008; Kusmierczyk et al, 2008; Yashiroda et al, 2008). Les études de Yashiroda et
al. et de Kusmierczyk et al. sont particulièrement intéressantes, malgré leur inélégance
d’avoir renommé Poc3-Poc4 respectivement en Dmp2-Dmp1 (Degradation of misfolded protein) et Pba3-Pba4 (Proteasome biogenesis-associated), plus de 6 mois après la publication de notre article.
2.2.1 Formation de l’anneau !
Tout d’abord, Yashiroda et al. et Kusmierczyk et al. ont montré que l’hétérodimère Poc3- Poc4 s’associe aux complexe précurseurs du protéasome via une interaction directe avec la sous-unité !5 : in vitro, parmi toutes les sous-unités ! et " testées, Poc3-Poc4 interagit seulement avec !5 (Yashiroda et al, 2008), seule ou bien complexée à d’autres sous-unités ! (Kusmierczyk et al, 2008). In vivo, les 7 sous-unités ! ainsi que la sous-unité "2/Pup1 sous- forme précurseur co-immunoprécipitent avec Poc4, en accord avec nos résultats (Yashiroda et al, 2008). Un intermédiaire d’assemblage formé de l’anneau ! et de "2 associé aux chaperons Poc1-Poc2 et Poc3-Poc4 semble donc précéder le 13S, qui est lui composé des 7 sous-unités !, de "2, "3, "4, Ump1 et Poc1-Poc2 (Li et al, 2007).
Il est probable que Poc3-Poc4 soit associé à l’anneau ! seul, voire même à un précurseur de l’anneau !. En effet, Yashiroda et al. et Kusmierczyk et al. ont montré que l’hétérodimère Poc3-Poc4 est nécessaire à la formation de l’anneau !. Son rôle exact diffère néanmoins selon les 2 études : assurer l’incorporation efficace de la sous-unité !4 au sein de l’anneau ! pour les premiers (Yashiroda et al, 2008), empêcher !4 de s’incorporer à la place d’!3 pour les seconds (Kusmierczyk et al, 2008), cette substitution ayant déjà été observée en absence d’!3 (Velichutina et al, 2004). L’incorporation d’!3 et !4, qui est probablement la dernière étape de la formation de l’anneau ! (au moins chez les mammifères, (Hirano et al, 2005)), apparaît à nouveau comme une phase critique de l’assemblage et semble donc sous le contrôle de Poc3-Poc4.
Nous avons observé une forte perturbation de la maturation du 20S en absence de Poc3-Poc4, visualisée dans les souches poc3! ou poc4! par l’accumulation des formes précurseurs des 3 sous-unités " catalytiques et la présence de propeptides au sein des protéasomes matures (Le Tallec et al, 2007). Ces effets peuvent être la conséquence d’une perturbation initiale de l’anneau ! ou résulter d’un rôle « actif » de Poc3-Poc4 dans l’incorporation de certaines sous- unités " au sein de l’anneau ! (au moins "2), ou bien de la combinaison des 2. En effet, même si le complexe Poc3-Poc4 n’interagit pas directement avec les sous-unité " in vitro16, il pourrait par exemple masquer certains sites potentiels de liaison des sous-unités " sur l’anneau !, et assurer ainsi leur positionnement correct (Yashiroda et al, 2008). Cependant, dans une souche poc4!, "2 semble toujours associée à l’anneau ! dépourvu d’!4 (Yashiroda
16 Pour mémoire, chez les mammifères, PAC3 interagit in vitro avec les sous-unités "3 et "4 (Hirano et al,
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et al, 2008). La formation d’un anneau ! correctement assemblé apparaît donc comme la fonction première de Poc3-Poc4.
2.2.2 Décrochage de Poc3-Poc4
Nous n’avons détecté qu’une très faible co-immunoprécipitation entre Ump1 et Poc3 ou Poc4 et proposé que l’hétérodimère Poc3-Poc4 soit associé aux complexes précurseurs du protéasome jusqu’à ce que Ump1 permette les étapes suivantes de maturation. Nous avons également observé une accumulation nucléaire de Poc3-Poc4 dans une souche ump1! (contrairement à leur localisation nucléo-cytoplasmique dans une souche sauvage), ce qui indique que Ump1 est très probablement impliquée dans le relargage de Poc3-Poc4 du complexe précurseur (Le Tallec et al, 2007). Est-ce alors la liaison d’Ump1 elle-même qui entraîne la dissociation de Poc3-Poc4 ? Aucune interaction entre Poc3-Poc4 et Ump1 n’a été détectée par Yashiroda et al. in vitro ni in vivo (Yashiroda et al, 2008). Yashiroda et al. ont résolu la structure du complexe Poc3-Poc4-!5 (voir ci-dessous) et établi un modèle du complexe anneau !-Poc3-Poc4-"4 qui suggére que la liaison de la sous-unité "4 sur l’anneau !, en provoquant un encombrement stérique entre "4 et Poc4, est à l’origine de la dissociation de Poc3-Poc4 (Yashiroda et al, 2008). Ces 2 modèles ne sont pas incompatibles : il est possible in vivo que l’association d’Ump1 (avant, simultanément ou après "4) soit nécessaire au positionnement approprié de "4 permettant le décrochage de Poc3-Poc4. La composition exacte du complexe précurseur auquel s’associe Ump1 reste par ailleurs à préciser.
2.2.3 Comparaison de Poc3-Poc4 avec PAC3
PAC3, homologue mammifère de Poc3, a été identifiée comme une protéine chaperonne du protéasome 20S nécessaire à l’assemblage de l’anneau ! et décrochée des complexes précurseurs avant la formation des hémiprotéasomes (Hirano et al, 2006), définition à laquelle répond également Poc3. Alors qu’Hirano et al. ont proposé que PAC3 agisse sous la forme d’un homodimère, nous avons identifié PAC4 comme homologue mammifère de Poc4 et montré que PAC3 et PAC4 fonctionnent également sous la forme d’un hétérodimère (Le Tallec et al, 2007). Outre cette découverte, une différence entre Poc3 et PAC3 nous est apparue surprenante : alors que "2 co-immunoprécipite avec Poc3, aucune interaction entre PAC3 et les sous-unités " n’est détectée chez les mammifères in vivo, bien que PAC3 se lie in
vitro à "3 et "4 (Hirano et al, 2006). Le même laboratoire est à l’origine de l’étude sur
Dmp1/Dmp2 ; de manière assez ironique, Yashiroda et al. ont retrouvé l’interaction de Poc3- Poc4 avec "2 in vivo, mais ce complexe n’interagit avec aucune sous-unité " in vitro (Yashiroda et al, 2008). Quid de l’interaction avec les sous-unités " ? Comme nous l’avons souligné dans la discussion de l’article, il est possible qu’il existe certaines différences entre PAC3-PAC4 chez les mammifères et Poc3-Poc4 chez la levure. A bien y regarder, ces divergences pourraient ne pas affecter seulement les sous-unités " : PAC3 interagit bien in
vitro avec une sous-unité !, mais il s’agit d’!2, et non pas d’!5 comme c’est le cas pour
Poc3-Poc4 (Hirano et al, 2006; Kusmierczyk et al, 2008; Yashiroda et al, 2008). A moins que les différences observées ne soient pas liées à une divergence évolutive mais à l’utilisation au sein des ces expériences in vitro de PAC3 seule versus le complexe Poc3-Poc4. Il serait donc particulièrement intéressant de tester in vitro les interactions de Poc3/PAC3 et Poc4/PAC4 isolées avec les sous-unités ! et " et de les comparer avec celles du complexe (il faut bien sûr pour cela que chaque protéine exprimée individuellement soit soluble, ce qui n’est
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malheureusement pas le cas pour Poc3 ni Poc4 (Le Tallec et al, 2007)). In vivo, nous avons par exemple observé que les profils des sous-unités ! co-immunoprécipitées avec PAC3 ou PAC4 lorqu’elles sont surexprimées indépendamment sont identiques, mais qu’ils diffèrent du profil obtenu lorsque PAC3 et PAC4 sont surexprimées ensemble (données non présentées). Le Dr R. Guérois avait établi pour le laboratoire les modèles structuraux des protéines Poc3, Poc4, PAC3 et PAC4 et montré que leur architecture est très proche. Plus, la structure prédite des hétérodimères Poc3-Poc4 et PAC3-PAC4 est très similaire à celle des sous-unités ! et " du 20S (données hélas non publiées, qui seront confirmées par Yashiroda et al. ; voir ci- dessous). Il est possible que Poc3/PAC3 ou Poc4/PAC4 puissent former des homodimères in
vitro ou in vivo, avec une spécificité de liaison des ! ou des " différente de celle de
l’hétérodimère. Interactions artéfactuelles ou signification physiologique ? L’avenir le dira… peut-être.
2.2.4 Structure de l’hétérodimère Poc3-Poc4
La résolution de la structure de Poc3, Poc4 et PAC3 par Yashiroda et al. a révélé une similitude structurale très importante entre ces 3 protéines, et ce malgré des séquences primaires peu conservées (Yashiroda et al, 2008). Elles présentent une structure globulaire, qui consiste en 6 feuillets " associés à 2, 3 ou 4 hélices ! (pour PAC3, Poc4 et Poc3, respectivement). La structure de l’hétérodimère Poc3-Poc4 est caractérisée par un repliement en « sandwich » des 2x6 feuillets " issus de Poc3 et Poc4, entouré de part et d’autre des hélices H1 et H3 de Poc4 et des hélices H2 et H4 de Poc3 (figure RII 1). Cette architecture ressemble étrangement à celle des sous-unités ! et " du protéasome 20S, à l’exception près que leur « sandwich » de feuillets " est formé de 2x5 feuillets (voir figure I 20). La structure cristallographique du complexe Poc3-Poc4-!5 a néanmoins montré que la liaison de Poc3- Poc4 avec !5 diffère de l’interaction !5-"5 qui implique leur hélice H1. Ce mode de liaison unique explique probablement le rôle de chaperon du protéasome 20S du complexe Poc3- Poc4 (Yashiroda et al, 2008).
Figure RII 1. Structure du complexe Poc3-Poc4 (Dmp2- Dmp1). Extrait de (Yashiroda et al, 2008)
La structure de l’hétérodimère Poc3-Poc4 est caractérisée par un repliement en « sandwich » de 2x6 feuillets " entouré de part et d’autre des hélices H1 et H3 de Poc4 et des hélices H2 et H4 de Poc3. A titre de comparaison, les sous-unités ! et " du protéasome 20S présentent un repliement commun caractérisé par 2x5 feuillets " entourés de part et d’autre par 2 hélices !, H1-H2 et H3-H4.
2.2.5 Conclusion
L’ensemble des études réalisées sur Poc3-Poc4 (PAC3-PAC4) permet de compléter le modèle d’assemblage du protéasome 20S présenté dans l’introduction (figure RII 2). Un modèle de plus en plus précis, où le rôle de contrôle-qualité des interfaces !/!, !/" et "/" par les
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protéines chaperonnes Poc1/2/3/4 et Ump1 est mis en lumière. L’assemblage du protéasome 19S demeure quant à lui toujours aussi mystérieux, et aucune protéine chaperonne n’est connue. Peut-être qu’Hsm3, le dernier membre du groupe fonctionnel « protéasome »…
Figure RII 2. Rôle des protéines chaperonnes Poc3-Poc4 dans l’assemblage du protéasome 13S de S.
cerevisiae
Deux hétérodimères de protéines chaperonnes, Poc1-Poc2 et Poc3-Poc4, participent à l’assemblage de l’anneau !. Poc1/Poc2 se lie aux sous-unités !5 et !7 libres et sert de plateforme d’assemblage pour l’anneau !. En parallèle, Poc3-Poc4 s’associe à !5 (du côté opposé à Poc1-Poc2 ?) et assiste l’incorporation des sous-unités !3 et !4. L’anneau ! sert de plateforme d’assemblage à l’anneau " : la sous-unité catalytique "2 (en bleu, propeptide en rouge) s’associe en premier, suivie de "3, "4 et de la protéine chaperonne Ump1, pour former le complexe précurseur 13S. La liaison de "4 sur l’anneau ! provoque un encombrement stérique entre "4 et Poc4, ce qui décroche Poc3-Poc4, qui est alors recyclé. Poc1 et Poc2 restent constamment associées aux complexes précurseurs, empêchant l’homodimérisation d’anneaux !, et seront dégradées à la fin de l’assemblage du protéasome 20S.
Ce modèle peut très probablement être étendu en grande partie à l’assemblage du protéasome 20S des eucaryotes supérieurs (où PAC1-PAC2 et PAC3-PAC4 jouent respectivement le rôle de Poc1-Poc2 et Poc3-Poc4).
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