Assemblage du protéasome 20S

La biogenèse d’une structure de 28 sous-unités, depuis la production de chaque protéine jusqu’à leur incorporation à une position spécifique, est nécessairement complexe. La synthèse des sous-unités ! catalytiques sous la forme de précurseurs inactifs implique en particulier une étape obligatoire de maturation. L’intégrité du protéasome 20S est ainsi

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assurée par l’assemblage précis et organisé des 14 sous-unités " et des 14 sous-unités !. On a longtemps présumé que la formation spontanée de l’anneau " constitue la première étape de l’assemblage, anneau sur lequel viendraient par la suite se greffer les sous-unités !. Grâce à de nombreux et récents travaux, fort heureusement, on présume de moins en moins. L’assemblage du 20S est décrit étape par étape dans les paragraphes suivants. Un schéma global est présenté sur la figure I 28.

3.5.1.1 Formation de l’anneau !

3.5.1.1.1 Un auto-assemblage ?

La présomption d’un auto-assemblage des sous-unités " est née de travaux de Zwickl et al. qui ont montré que la sous-unité " de l’archébactérie T. acidophilum exprimée chez E. coli s’assemble en anneaux homo-heptamériques indistinguables des anneaux terminaux retrouvés au sein du protéasome 20S (Zwickl et al, 1994). Les travaux de Zwickl et al. ont de plus posé les bases (i) d’un auto-assemblage global du protéasome en montrant que la co-expression des sous-unités " et ! du protéasome de T. acidophilum produit des protéasomes catalytiquement actifs et (ii) de la préséance de la formation d’un anneau " au cours de l’assemblage en révélant que l’expression de la sous-unité ! seule chez #. coli conduit uniquement à des protéines monomériques sous forme de précurseurs (Zwickl et al, 1994). Une analyse similaire a été menée par Gerards et al. en exprimant cette fois chez E. coli des sous-unités du protéasome humain (Gerards et al, 1997). Comme observé pour la sous-unité " archébactérienne, la protéine recombinante "7 s’auto-assemble en une structure heptamérique en anneau ; le complexe formé consiste en fait en 2 anneaux contenant chacun 7 protéines, indiquant une auto-dimérisation des anneaux "7. L’expression de 2 sous-unités ! distinctes, !1 ou !7, conduit au mieux à un tétramère. Ces résultats suggèrent que les anneaux " jouent un rôle initiateur dans l’assemblage du 20S eucaryote. Cependant, contrairement à T.

acidophilum, la co-expression d’"7 avec !1 ou !7 ne permet pas la formation d’un

protéasome. Ce résultat n’est pas surprenant outre mesure compte tenu de la diversification des sous-unités " et ! chez les eucaryotes et du positionnement spécifique de chacune des sous-unités au sein du 20S ; il met plutôt en lumière une certaine incongruité des anneaux "7 observés. Néanmoins, la sous-unité recombinante "5 de Trypanosoma brucei est elle aussi capable de s’assembler en anneaux heptamériques, plus précisément de former un cylindre composé de 4 anneaux (Yao et al, 1999). L’auto-assemblage en anneau ne semble pas être une propriété intrinsèque de toutes les sous-unité " eucaryotes : les protéines recombinantes humaines "1 et "6 ne forment chacune in vitro que des dimères (Gerards et al, 1998).

Parallèlement à ces résultats, l’identification in vivo de sous-complexes du protéasome composés d’un anneau " complet et de certaines sous-unités ! sous forme précurseur, correspondant à des intermédiaires d’assemblage appelés hémiprotéasomes (voir ci-dessous), a indiqué que la formation du protéasome se fait de manière séquentielle, par étape, la première consistant donc très probablement à assembler l’anneau " (Frentzel et al, 1994; Patel et al, 1994; Yang et al, 1995). Néanmoins, c’est une étude récente qui a considérablement fait progresser notre compréhension des premières étapes de la biogenèse du protéasome. Hirano et al. ont en effet confirmé in vivo chez les mammifères que l’anneau " est le premier intermédiaire d’assemblage du protéasome 20S, tout en démontrant que sa

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formation est assistée par un dimère de protéines, PAC1 et PAC2 (Proteasome Assembling Chaperone) (Hirano et al, 2005).

3.5.1.1.2 Les protéines chaperonnes PAC1 et PAC2

PAC1 et PAC2, 2 protéines respectivement de 288 et 264 résidus, sont ubiquitaires chez les mammifères. In vitro, PAC1 et PAC2 forment un hétérodimère. Un complexe formé des 7 sous-unités ", de PAC1 et de PAC2 mais dépourvu de sous-unités ! est isolé in vivo par immunoprécipitation. PAC1 et PAC2 sont également associées à l’hémiprotéasome jusqu’à la formation des formes matures du 20S. Pour caractériser plus avant la fonction du complexe PAC1-PAC2, des siRNA (short interfering RNA) ont été utilisés pour éteindre l’expression de leur gène respectif. En résulte l’accumulation des sous-unités " au sein de complexes correspondant à des dimères d’anneaux ", ce qui indique que l’hétérodimère PAC1-PAC2 a un rôle clé dans l’assemblage du 20S en empêchant la dimérisation des anneaux ", les maintenant ainsi dans un état propre à lier les sous-unités ! et à poursuivre la formation du 20S. PAC1 et PAC2 ont une demie-vie courte et similaire estimée par pulse chase à une quarantaine de minutes. Leur demie-vie est de plus prolongée quand les cellules sont traitées au MG132, un inhibiteur du protéasome, ce qui suggère que PAC1 et PAC2 sont dégradées par le protéasome. La durée d’assemblage du 20S est estimée à 1h chez les mammifères (Ahn et al, 1996) ; la demie-vie de PAC1 et PAC2 est donc compatible avec un rôle de chaperon du 20S pour l’hétérodimère PAC1-PAC2 suivi de sa dégradation une fois l’assemblage terminé. Afin de déterminer si PAC1 et PAC2 se fixent à l’anneau " pré-assemblé ou si elles participent à sa formation, Hirano et al. ont testé l’interaction du complexe PAC1-PAC2 avec chaque sous-unité " in vitro, et ont détecté une association spécifique avec les sous-unités "5 et "7. Toujours in vitro, l’interaction d’"5 avec les 6 autres " est augmentée en présence de PAC1-PAC2. Enfin, Hirano et al. ont identifié in vivo un complexe PAC1-PAC2-sous-unités " duquel "3 et "4 sont absentes, confirmant que PAC1 et PAC2 s’associent aux " avant que l’anneau ne soit complet et pointant vers une incorporation ordonnée des sous-unités " au sein de l’anneau. L’ensemble de ces données indiquent que l’hétérodimère PAC1-PAC2 participe directement à l’assemblage de l’anneau ", tout en limitant la formation de dimères illégitimes et improductifs d’anneaux " (figure I 25). Ce n’est d’ailleurs certainement pas un hasard si PAC1-PAC2 interagit spécifiquement avec les sous-unités "5 et "7 : leur capacité à s’auto-assembler en anneau heptamérique a été démontrée, tout comme leur propension à former des dimères ou des tétramères d’anneaux (voir ci-dessus). De plus, "5 peut induire in

vitro la formation en anneau heptamérique de sous-unités " ("1 ou "6) qui en sont

intrinsèquement incapables (Gerards et al, 1998). Le complexe PAC1-PAC2 pourrait donc servir à « canaliser » la capacité d’auto-assemblage d’"5 et "7, et à la diriger vers la formation d’un anneau " comprenant les 7 sous-unités. Il a été montré chez les mammifères que la phosphorylation de la sous-unité "7 augmente son incorporation au sein du protéasome (Rivett et al, 2001). Cette modification post-traductionnelle pourrait peut-être influencer l’interaction de PAC1-PAC2 avec "7. Enfin, sans trop en dévoiler, précisons seulement que le complexe homologue de PAC1-PAC2 chez S. cerevisiae a été très récemment identifié.

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A.

B.

Figure I 25. Formation de l’anneau " assistée par l’hétérodimère PAC1-PAC2

A. Un hétérodimère PAC1-PAC2 se lie aux sous-unités "5 et "7 libres et sert de plateforme d’assemblage pour l’anneau ", auquel "3 et "4 semblent s’incorporer en dernier. PAC1 et PAC2 seront dégradées par le protéasome 20S à la fin de l’assemblage.

B. En absence de PAC1 et/ou PAC2, des dimères d’anneaux " sont susceptibles de se former.

Au vu des résultats que nous venons d’évoquer, il est évident qu’un anneau " correctement formé est indispensable à l’assemblage efficace du protéasome 20S. Or, chez la levure S.

cerevisiae, un gène parmi les 7 codant les sous-unités " n’est pas essentiel. Il s’agit de PRE9

codant la sous-unité "3 (Emori et al, 1991). Comment expliquer cette exception ? Velichutina

et al. ont répondu à cette question en purifiant les protéasomes d’une souche pre9". Ils ont

ainsi montré que deux sous-unité "4 sont présentes, l’une prenant la place laissée vacante par "3 (Velichutina et al, 2004). Il existe donc une certaine plasticité au sein de l’anneau " du 20S. Cependant, la biogenèse du protéasome dans les mutants pre9" est perturbée, la formation des hémiprotéasomes étant particulièrement retardée (Velichutina et al, 2004), ce qui démontre qu’un positionnement correct des sous-unités " au sein de l’anneau est important pour les étapes suivantes d’assemblage. Le remplacement d’"3 par "4 et son impact mesuré sur le protéasome sont en accord avec les observations d’Hirano et al. qui suggèrent qu’"3 et "4 sont les dernières sous-unités " incorporées (voir ci-dessus).

Notons enfin que l’assemblage du protéasome 20S, et en particulier les premières étapes, diffère sensiblement chez certaines eubactéries. Le 20S de Rhodococcus erythropolis est composé de 2 sous-unités " et 2 sous-unités ! différentes. Chaque sous-unité " ou ! exprimée séparément reste à l’état de monomère, alors que la co-expression d’un couple "/! entraîne la formation d’un protéasome actif (Zuhl et al, 1997). In vivo, la formation d’un hétérodimère

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"/! est observée au cours de l’assemblage, qui se poursuit néanmoins, comme chez les archébactéries et les eucaryotes, par l’apparition d’un hémiprotéasome (Sharon et al, 2007).

3.5.1.2 Formation des hémiprotéasomes

3.5.1.2.1 Composition des hémiprotéasomes

5 des 7 sous-unités ! (les 3 sous-unités ! catalytiques !1/!1i, !2/!2i et !5/!5i ainsi que !6 et !7) sont synthétisées sous la forme de précurseurs comprenant un propeptide N-terminal qui est absent des protéasomes 20S (Heinemeyer et al, 2004). Une étape de maturation a donc lieu au cours de l’assemblage du 20S. On emploie le terme générique « hémiprotéasome » pour désigner les intermédiaires d’assemblage contenant l’anneau " et les formes précurseurs des sous-unités ! (ainsi que les protéines chaperonnes PAC1-PAC2 et Ump1, voir ci-dessous). Travaillant sur les immunoprotéasomes, Patel et al. ont été les premiers à décrire des sous- complexes du protéasome 20S comprenant spécifiquement les formes précurseurs de !1i et !5i, suggérant qu’ils correspondent à des complexes précurseurs du 20S (Patel et al, 1994). Peu après, Frentzle et al. puis Yang et al. ont confirmé par des expériences de marquage radioactif en pulse-chase que le protéasome 20S s’assemble irréversiblement à partir d’intermédiaires d’assemblage (13S pour Frentzel, 15S pour Yang) contenant les " et les précurseurs des sous-unités ! (Frentzel et al, 1994; Yang et al, 1995). Yang et al. ont analysé la composition en sous-unités du 15S et ont détecté la présence des 7 sous-unités " ainsi que de sous-unités ! dont les 3 sous-unités catalytiques !1i, !2i et !5i sous la forme de précurseurs. Ils ont alors proposé un modèle d’assemblage du 20S où l’anneau " est tout d’abord formé et sert de plateforme d’assemblage aux 7 sous-unités !, donnant naissance à un hémiprotéasome, 2 hémiprotéasomes s’associant pour former le 20S mature, un processus couplé au clivage des propeptides N-terminaux (Yang et al, 1995). Un modèle étonnamment proche du modèle actuel (figure I 27), qui sera d’ailleurs vite repris et complété, en particulier pour ce qui concerne l’ordre d’assemblage des !. Un intermédiaire d’assemblage 13S (celui-là même identifié par Frentzel et al.) précède en effet le 15S. Il est composé d’un anneau ", de !3, !4 et de la forme précurseur de !2, chez les mammifères comme chez la levure (Frentzel et al, 1994; Schmidtke et al, 1997; Li et al, 2007) (figure I 26). Le premier intermédiaire d’assemblage détecté pour l’immunoprotéasome comprend l’anneau ", !3, !4 et les formes précurseurs de !1i et !2i ; les sous-unités !5i, !6 et !7 s’incorporent par la suite (Nandi et al, 1997). Des études récentes chez la levure ont montré que la sous-unité !7 est absente du 15S et est intégrée en dernier au protéasome (voir paragraphe 3.5.1.3.4) (figure I

26). Le complexe 16S (également identifié par Frentzel et al.) contenant toutes les sous-unités

" et ! a été décrit chez les mammifères (Frentzel et al, 1994; Schmidtke et al, 1997; Witt et al, 2000).

3.5.1.2.2 Fonction(s) des propeptides des sous-unités !

Le propeptide de la sous-unité ! de l’archébactérie T. acidophilum n’est pas nécessaire à l’assemblage du protéasome (Zwickl et al, 1994). Au contraire, plusieurs études chez les eucaryotes ont rapporté que les propeptides de certaines sous-unités ! ont un rôle crucial dans la biogenèse du 20S. Le propeptide de !5 (correspondant aux acides aminés situés en amont de la thréonine 76 qui deviendra la thréonine 1 active après clivage) est ainsi indispensable à

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son incorporation au sein du protéasome chez S. cerevisiae. Il est donc essentiel à la viabilité cellulaire. De plus, il peut agir en trans : même séparé du domaine mature de !5, il est capable de permettre son intégration dans le protéasome. Le propeptide de !5 peut ainsi être considéré comme un chaperon intramoléculaire (Chen & Hochstrasser, 1996). La fonction du propeptide de !5 ne peut cependant pas être généralisée à l’ensemble des propeptides des sous-unités ! de la levure : l’absence des propeptides de !1 ou !2 n’est pas létale et n’entraîne pas de défaut majeur d’assemblage du protéasome (Arendt & Hochstrasser, 1999). Les propeptides diffèrent significativement en taille en en séquence, et ne sont pas interchangeables : une protéine chimère constituée du propeptide de !1 et du domaine mature de !5 ne s’incorpore pas au protéasome (Chen & Hochstrasser, 1996). Une fonction commune aux propeptides des 3 sous-unités ! catalytiques visant à protéger la thréonine N- terminale catalytique d’une N"-acétylation inactivatrice a été proposée par Arendt et al. (Arendt & Hochstrasser, 1999).

Figure I 26. Formation des complexes précurseurs 13S et 15S

Après l’anneau ", le second intermédiaire d’assemblage détecté chez les eucaryotes correspond au protéasome 13S, composé de l’anneau " et des sous-unités !2 (sous forme précurseur), !3 et !4. S’ensuit l’incorporation de !1, !5 et !6 pour former le 15S. Le propeptide de !5 est indispensable à son incorporation dans le protéasome chez la levure S. cerevisiae. La protéine chaperonne Ump1 est détectée dès le complexe 13S. Les sous-unités ! catalytiques sont en bleu, les propeptides sont figurés par des « queues » rouges (!1, !2, !5) ou noire (!6).

Le rôle et l’influence des propeptides semblent quelque peu différents chez les mammifères. Comme chez la levure pour !1, l’absence du propeptide de !1i n’affecte pas l’incorporation de la sous-unité dans le protéasome (Schmidt et al, 1999). Mais contrairement à !5 de S.

cerevisiae, le propeptide de !5i n’est pas indispensable à l’intégration de !5i dans le

protéasome (Witt et al, 2000). L’incorporation de !5i en absence de son propeptide est néanmoins peu efficace. Elle provoque de plus un important retard de maturation du protéasome et l’accumulation des complexes précurseurs (Witt et al, 2000). Des données plus anciennes avaient d’ailleurs conclu à un défaut total d’incorporation en absence de pro!5i (Cerundolo et al, 1995). Schmidtke et al. ont montré qu’une protéine chimère formée du propeptide de !5i et de la forme mature de !1i est incorporée au protéasome mais n’est pas

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convenablement maturée, des formes intermédiaires de clivage étant retrouvées dans le 20S. Chez les mammifères, la fonction des propeptides, plutôt que le ciblage au protéasome, serait donc d’assurer le positionnement précis des précurseurs permettant un clivage efficace des propeptides (Schmidtke et al, 1996).

3.5.1.2.3 Fonction(s) des extensions C-terminales des sous-unités ! En plus des propeptides, les extensions C-terminales de certaines ! influencent l’assemblage du protéasome. Il a ainsi été montré que la partie C-terminale de la sous-unité catalytique !2, qui s’enroule autour de !3 au sein du même anneau (Groll et al, 1997; Unno et al, 2002), est essentielle à la biogenèse du protéasome chez S. cerevisiae (Ramos et al, 2004). La délétion des 30 résidus carboxyterminaux de !2/Pup1 est létale ; une explication possible est que la sous-unité !3, maintenue en place par !2, ne peut pas s’incorporer correctement en absence de cette queue C-terminale, conduisant à un défaut d’assemblage et de maturation du protéasome (Ramos et al, 2004). La queue C-terminale de !7 est également un acteur important de l’assemblage du protéasome (voir paragraphe 3.5.1.3.4).

3.5.1.3 Dimérisation des hémiprotéasomes

Il est fréquent que les protéases soient synthétisées avec un propeptide N-terminal qui inhibe leur activité protéolytique, empêchant ainsi une activation non-régulée et la dégradation illégitime de protéines. Dans le cas du protéasome, il a été proposé très tôt que le clivage des précurseurs des sous-unités ! soit étroitement lié à la formation du 20S mature à partir des hémiprotéasomes, chez les mammifères (Frentzel et al, 1994; Yang et al, 1995) comme chez la levure (Chen & Hochstrasser, 1995).

3.5.1.3.1 Couplage de la dimérisation et du clivage des précurseurs En 1996, au cours de leur étude sur les propriétés du propeptide de !5 chez S. cerevisiae, Chen et Hochstrasser ont analysé le mécanisme de formation des sites catalytiques du protéasome (Chen & Hochstrasser, 1996). Peu auparavant, il avait été démontré que le protéasome de l’archébactérie T. acidophilum est une protéase à thréonine, le résidu thréonine actif étant localisé à l’extrémité N-terminale de la forme ! clivée (Lowe et al, 1995; Seemuller et al, 1995). A cette époque, 3 sous-unités ! eucaryotes sur les 7 (!1, !2 et !5) sont apparues posséder les résidus requis pour être catalytiquement actives. 2 résidus en particulier sont rigoureusement conservés : la glycine immédiatement en amont du site de clivage, et la thréonine immédiatement en aval, qui deviendra la thréonine active (Chen & Hochstrasser, 1995; Seemuller et al, 1995). Après avoir montré que la sous-unité !5 est intégrée à l’hémiprotéasome grâce à son propeptide N-terminal, Chen et Hochstrasser se sont penchés sur le rôle du clivage de pro!5. Pour ce faire, ils ont muté les résidus glycine et thréonine flanquant le site de coupure du propeptide, et ont obtenu des formes non-clivables de pro!5. Ils ont alors montré qu’une forme mutante !5 dont le propeptide ne peut être clivé est incorporée au protéasome, mais que le protéasome mutant demeure catalytiquement inactif pour l’activité de type chymotrypsine, alors que ses autres activités protéolytiques (de type trypsine et caspase) ne sont pas affectées. Le clivage du propeptide de !5 n’est donc pas nécessaire à l’assemblage du protéasome mais est indispensable, spécifiquement, à l’activation de l’activité chymotrypsique portée par !5 en révélant sa thréonine active (devenue N-terminale) (Chen & Hochstrasser, 1996).

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L’absence de formes précurseurs des ! dans les protéasomes 20S ou d’intermédiaires d’assemblage contenant des sous-unités ! matures avait déjà suggéré que les étapes finales de formation du 20S, c’est à dire la dimérisation de 2 hémiprotéasomes et le clivage des propeptides, se déroule de façon très rapprochée (Frentzel et al, 1994; Yang et al, 1995). En montrant que l’interaction de la sous-unité !4 avec la forme précurseur de !5 à l’interface entre 2 anneaux ! est indispensable au clivage de pro!5, Chen et Hochstrasser ont fortement accrédité l’hypothèse d’un couplage entre le clivage des propeptides et la dimérisation des hémiprotéasomes (Chen & Hochstrasser, 1996). Un tel mécanisme associant étroitement assemblage et maturation empêche ainsi l’activation des sites catalytiques jusqu’à ce qu’une chambre protéolytique confinée soit formée par l’association de 2 hémiprotéasomes.

3.5.1.3.2 Clivage autocatalytique des précurseurs

Chen et Hochstrasser ont proposé que la formation des sites catalytiques du protéasome 20S mature repose sur des interactions spécifiques entre les 2 anneaux ! centraux (Chen & Hochstrasser, 1995). Puis l’ont démontré. L’interaction de !5 d’un hémiprotéasome avec la sous-unité !4 de l’autre hémiprotéasome est en effet cruciale pour l’activité de type chymotrypsique du protéasome. Cette même interaction est également indispensable au clivage du propeptide de !5. En d’autres termes, la juxtaposition inter-anneaux ! de !5 avec !4 permet la mise en place d’une conformation tout à la fois apte à activer le site catalytique de !5 et à cliver son propeptide ; ces données suggèrent donc que le propeptide de !5 est clivé de manière autocatalytique (Chen & Hochstrasser, 1996).

En parallèle, des travaux réalisés sur la sous-unité !1i ont confirmé in vitro que les propeptides des sous-unités ! catalytiques sont séparés des domaines matures par autolyse entre les résidus glycine -1 (précédant la thréonine active) et la thréonine 1 (la thréonine active) (Schmidtke et al, 1996). Enfin, contrairement à la sous-unité ! de T. acidophilum pour lequel a été proposé un clivage autocatalytique intermoléculaire du précurseur de la sous-unité ! (Seemuller et al, 1996), Schmidtke et al. ont suggéré une autolyse intramoléculaire en cis, ayant observé que le clivage autocatalytique de pro!1i est indépendant de la présence des autres sous-unités ! actives et que, réciproquement, le clivage de !2i et !5i n’est pas affecté par une forme mutante non-clivable de pro!1i (Schmidtke et al, 1996). Ces observations font d’ailleurs parfaitement écho aux résultats de Chen et Hochstrasser, en particulier au fait que l’abolition du clivage de pro!5 affecte uniquement et spécifiquement l’activité chymotrypsique (Chen & Hochstrasser, 1996). Même si la présence de 2 sous-unité catalytiques identiques, une au sein de chaque hémiprotéasome, rend difficile une telle conclusion, des études structurales ont depuis conforté le modèle d’autolyse en cis des sous- unités ! (Ditzel et al, 1998; Groll et al, 1999).

En résumé, l’association des 2 hémiprotéasomes permet la mise en place de conformations spécifiques capables d’induire le clivage autocatalytique des propeptides des sous-unités !. Cette étape est évidemment cruciale dans l’assemblage du 20S, et l’identification chez la levure d’Ump1, une protéine chaperonne assistant ce processus, a confirmé cette vision.

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3.5.1.3.3 Ump1, LE chaperon du protéasome 20S

Bien qu’elle agisse à une étape plus tardive de l’assemblage que PAC1 et PAC2, Ump1