Analyse phénotypique des suppresseurs et implication des suppresseurs dans la voie de réponse aux dommages de l’ADN

6.2.1 Test de sensibilité des suppresseurs au 4NQO, à la camptothécine et à l’hydroxyurée

Les 110 suppresseurs identifiés dans notre crible, en tant qu’activateurs ou cibles potentiels de Rad53, semblent par là-même impliqués dans la réponse au stress génotoxique. Cependant, la suppression de RAD53-DL peut être due à des mécanismes difficiles à décrypter, voire à des effets tout à fait indirects. Partant du principe que l’absence d’un gène impliqué dans la réponse à un stress donné entraîne une modification de la sensibilité à ce stress, nous avons testé la sensibilité de chaque suppresseur, en absence de RAD53-DL, à trois agents génotoxiques : la CPT, le 4NQO et l’hydroxyurée (HU). Comme nous l’avons souligné au cours de l’introduction, un stress génotoxique spécifique entraîne une réponse cellulaire spécifique, impliquant seulement les protéines appropriées. En testant un panel de 3 drogues provoquant différents types de dommages de l’ADN et donc différentes réponses (pour mémoire, l’hydroxyurée ralentit les fourches de réplication, la CPT provoque des cassures double-brin de l’ADN et le 4NQO modifie les bases de l’ADN (Friedberg et al, 2005)), nous pouvons révéler l’implication de protéines participant aussi bien à une seule qu’à plusieurs voies de la DDR. Précisons enfin que ces 3 stress génotoxiques affectent évidemment tous la viabilité d’une souche rad53". Les résultats sont présentés dans le tableau RI 3.

Pour une plus grande fiabilité, l’analyse phénotypique a été réalisée sur les mutants des 2 types sexuels de la banque de délétants. De manière générale, les mutants BY4741 et BY4742 présentaient le même comportement tant en croissance sur milieu riche qu’en présence de stress. Pour une dizaine de mutants, néanmoins, les phénotypes variaient d’une souche à l’autre. La reconstruction de la délétion incriminée, pour ces souches mais aussi pour tous les suppresseurs d’intérêt, est donc indispensable.

6.2.2 Tests d’épistasie et groupes fonctionnels

Un quart des suppresseurs ont montré une sensibilité différente de la souche sauvage à l’un au moins des stress génotoxiques testés. De façon surprenante, alors que l’on attendait plutôt une hypersensibilité aux dommages de l’ADN, la moitié de ces mutants sont apparus hyper- résistants au 4NQO et/ou à la CPT (tableau RI 3). C’est notamment le cas des trois mutants du NMD, nam7!, nmd2! et upf3!. Les 3 mutants du NMD sont non seulement tous hyper- résistants au 4NQO, mais ils présentent également le même niveau de résistance, retrouvé dans chaque combinaison de doubles mutants (figure RI 12B). Ces résultats sont compatibles avec le mode d’action supposé des 3 protéines du NMD sous forme de complexe : le NMD est inactivé si un seul de ses composants est absent (Baker & Parker, 2004).

Un raisonnement similaire suggère l’existence d’un complexe pour les 3 membres du groupe fonctionnel OCA1/YCR095C/YHL029C, dont les mutants respectifs sont tous hypersensibles au 4NQO, à la camptothécine et à l’hydroxyurée, et ce dans les mêmes proportions. Comme pour le NMD, nous avons vérifié cette hypothèse grâce à un test d’épistasie. Si, dans le cas de deux suppresseurs sensibles à un stress génotoxique, leur sensibilité ne s’additionne pas au sein d’un double-mutant, c’est qu’elle met en jeu une voie commune aux deux suppresseurs

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étudiés. Les différentes combinaisons des mutants oca1!, ycr095c! et yhl029c! donnant à chaque fois le phénotype d’un des simples mutants, on peut effectivement penser que ces 3 protéines forment un complexe (figure RI 14). D’ailleurs, YCR095C et YHL029C ont récemment été rebaptisés OCA4 et OCA5 sur SGD.

Sensibilité aux stress génotoxiques

ORF Protéine 4NQO CPT HU YDR217C Rad9 S S S YMR080C Nam7/Upf1 R R - YHR077C Nmd2/Upf2 R R - YGR072W Upf3 R R - YGL094C Pan2 R - -

YGR178C Pbp1 n/a n/a n/a

YDR395W Sxm1 R R - YNL099C Oca1 S S S YHL029C ? S S S YCR095C ? S S S YDR363W-A Sem1 R R S ? YGR135W Pre9 R R S ? YBR173C Ump1 R R S ? YLR021W ? R R S ? YPL144W ? R R S ? YLR199C ? R R S ? YKL206C ? R R S ? YBR272C Hsm3 R R S ? YPL055C Lge1 S S S YDR073W Snf11 R - - YOR189W Ies4 - - S YER092W Ies5 S S S YOR191W Ris1 - - - YOR279C Rfm1 S? S? S? YGL194C Hos2 S? - - YMR039C Sub1 S S S YPL139C Ume1 S - - YIL011W Tir3 R - -

Tableau RI 3. Sensibilité des suppresseurs au stress génotoxique

S : hyper-sensibilité. R : hyper-résistance. - : sensibilité similaire à celle d’une souche sauvage. n/a : non testé. Seuls les suppresseurs présentant une sensibilité différente de celle d’une souche sauvage à au moins un des stress génotoxiques testés figurent dans ce tableau

De la même façon, des tests d’épistasie ont été réalisés entre les différents mutants présentant un phénotype en présence de stress génotoxique pour révéler l’existence de voies fonctionnelles communes. En particulier, 5 suppresseurs de fonction inconnue (correspondant aux gènes YLR021W, YPL144W, YLR199C, YKL206C et HSM3) sont hyper-résistants à la fois au 4NQO et à la CPT, alors qu’ils semblent (très) légèrement sensibles à l’hydroxyurée, caractéristiques partagées, de façon surprenante, par les 3 mutants du protéasome sem1!,

pre9! et ump1! (figure RI 15). En effet, c’est la première fois, à notre connaissance, qu’un

tel phénotype est révélé pour ces mutants, le protéasome apparaissant dans la littérature comme un régulateur positif de la réponse aux dommages de l’ADN (voir discussion). La combinaison de chacun des 5 mutants « inconnus » avec chacun des 3 mutants du protéasome

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n’a jamais révélé la moindre additivité de résistance au 4NQO (voir résultats). Ces 8 mutants appartiennent donc au même groupe d’épistasie concernant la réponse aux dommages de l’ADN. En d’autres termes, les gènes YLR021W, YPL144W, YLR199C, YKL206C et HSM3 font partie de la voie du protéasome. Les interactions décrites dans les bases de données pour ces 5 gènes (interaction physique entre Ylr021w et Ypl144w (Krogan et al, 2006), entre Ylr199c et Ykl206c ou Ump1 (Krogan et al, 2006), ou entre Hsm3 et la majorité des sous- unités du 19S (Gavin et al, 2002)) ne disent pas le contraire. Le début d’une longue histoire. L’hyper-résistance au 4NQO est une caractéristique partagée par les mutants du protéasome et ceux du NMD, en plus de leur capacité à supprimer la toxicité de RAD53-DL. Il pourrait donc exister des interactions fonctionnelles entre le NMD et le protéasome (des tests d’épistasie permettraient de le déterminer). A ce titre, il est intéressant de noter qu’un crible génétique recherchant des gènes impliqués dans la dégradation d’ARNm dépourvus de codon stop a récemment isolé plusieurs mutants du protéasome (Wilson et al, 2007).

A. B.

Figure RI 14. Effet suppresseur de RAD53-DL et sensibilité au stress génotoxique des mutants oca1!,

yhl029c! et ycr095c!

A. Suppression de la toxicité de RAD53-DL par les mutants oca1!, ycr095c! et yhl029c!. Des dilutions sériées des souches BLT12, BLT15, RAD53-DL oca1!, RAD53-DL yhl029c! et RAD53-DL ycr095c! ont été spottées

sur milieu YPD en conditions permissives (+Dox) ou restrictives (-Dox). Les cellules ont été incubées 2 jours à 30°C.

B. Résistance au 4NQO des mutants oca1!, ycr095c! et yhl029c! et des différentes combinaisons de double mutants. Des dilutions sériées d’une souche sauvage (WT) et des différents mutants indiqués ont été spottées sur milieu YPD seul ou additionné de CPT (5µg/mL), 4NQO (0,1µg/mL) ou HU (100mM). Les cellules ont été incubées 2 jours à 30°C.

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Enfin, pour tous les suppresseurs ayant montré une sensibilité à un stress génotoxique, il est bien entendu possible de tester s’ils font partie de la voie Rad53 en inactivant RAD53 au sein de chaque mutant et en déterminant si leur sensibilité s’ajoute ou non à celle de rad53!.