Le crible en pratique

Une fois définie, chaque étape a fait l’objet d’une rigoureuse mise au point avant passer à sa réalisation. La composition des milieux, la concentration des antibiotiques et les protocoles utilisés sont précisés dans les Supplemental data de (Le Tallec et al, 2007).

3.1 Conjugaison

Afin de maximiser l’efficacité de conjugaison, des cultures en phase exponentielle de la souche appât et des groupes de délétants seront croisées pendant 5 heures sur un milieu riche en présence de doxycycline.

Résultats et discussion / Un crible à l’échelle du génome chez S. cerevisiae pour identifier de nouveaux partenaires de Rad53

Figure RI 6. Schéma général du crible suppresseur de la toxicité de RAD53-DL

RAD53-DL a été introduit dans les 4627 délétants de la collection EUROSCARF en utilisant une version

reformatée de la banque composée de 43 groupes de 110 souches. Les cellules haploïdes associant dans leur génome l’allèle RAD53-DL et une délétion et capables de pousser en absence de doxycycline ont été sélectionnées.

3.2 Sélection des diploïdes

Comme nous l’avons vu, les diploïdes issus d’un croisement entre BY4741 (fond génétique de la collection de mutants) et BY4742 (fond génétique de BLT15) peuvent être facilement sélectionnés sur un milieu dépourvu à la fois de de lysine et de méthionine. Une contrainte intrinsèque au fond génétique BY47XX nous a fait adopter un autre protocole. Comme il a été précisé plus haut, le taux de sporulation est faible, et exige des conditions de présporulation particulières, en l’occurrence la culture des diploïdes en milieu enrichi en glucose, le milieu GNA, ce qui proscrit l’utilisation des marqueurs d’auxotrophie. Restent alors les cassettes de résistance aux antibiotiques. Le génome issu des délétants permettra de pousser en présence de généticine, mais la cassette P!NATMX4 apportée par BLT15 ne sera quant à elle pas exprimée dans les diploïdes. La souche appât a donc été au préalable transformée avec le plasmide pGID1 (un nouveau don du Dr Alain Jacquier – mais qui d’autre ?) portant une cassette de résistance à l’antibiotique hygromycine B (Sambrook & Russell, 2001). Après croisement de BLT15+pGID1 avec les 43 groupes de délétants sur GNA+doxycycline, les

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diploïdes seront ensuite sélectionnés sur GNA+doxycycline+hygromycine+généticine sur la nuit (figure RI 7).

Après la sélection des diploïdes, le plasmide pGID1 pourrait se maintenir dans les cellules jusqu’au stade de sélection des suppresseurs. C’est pourquoi nous avons vérifié que pGID1 n’a aucune influence sur la toxicité de RAD53-DL (données non présentées).

Figure RI 7. Sélection des diploïdes

La souche appât a été transformée avec le plasmide pGID1 conférant la résistance à l’hygromycine. Après croisement avec la banque de délétants (qui sont résistants à la généticine), les diploïdes sont sélectionnés sur GNA+hygromycine+généticine en conditions permissives.

3.3 Sporulation

C’est l’étape critique du crible : obtenir un nombre suffisant de cellules haploïdes associant

RAD53-DL à une délétion donnée malgré un taux de sporulation très faible. En effet, la mise

au point de cette étape a révélé que la doxycycline, indispensable pour empêcher l’expression de RAD53-DL, inhibe fortement la sporulation.

Ainsi, en utilisant les conditions de présporulation en GNA et de sporulation en milieu liquide (5 jours à 25°C puis 3 jours à 30°C) conseillés pour les diploïdes BY47XX, on retrouve un taux de sporulation proche des 20% annoncés sur le site du Saccharomyces Genome Deletion Project. Or ce taux chute en dessous de 1% en présence de doxycycline à la concentration de 5mg/mL nécessaire à une répression optimale de RAD53-DL. D’autres laboratoires utilisant cet antibiotique ont constaté le même effet (communications personnelles). Celui-ci semblerait lié à une perte des mitochondries induite par la doxycycline, ce qui perturberait in

fine la sporulation (pour l’influence de la respiration et du génome mitochondrial sur la

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Après sporulation, notre objectif est d’obtenir, pour chaque gène inactivé, au moins 100 clones associant RAD53-DL et la délétion. Le nombre X de diploïdes à mettre à sporuler pour chaque groupe de délétants va donc dépendre de :

• a, le nombre de délétants par groupe, soit 110 en moyenne

• b, le nombre souhaité de clones haploïdes associant RAD53-DL et une délétion particulière, ici 100

• c, le taux de sporulation des diploïdes. Nous espérons au minimum 0,5% de sporulation

• d, la probabilité d’obtenir un haploïde associant RAD53-DL et une délétion particulière, soit 0,25 (25% des spores en moyenne, moins pour les délétions proches du locus TRP1 où a été intégré RAD53-DL)

• e, la probabilité que la souche haploïde associant RAD53-DL et une délétion particulière soit de type sexuel Mat! permettant l’expression de la cassette de résistance P!NATMX4, soit en moyenne 0,5 (mais évidemment moins pour les délétions proches du locus MAT)

Soit X=(a*b)/(c*d*e)=(110*100)/(0,005*0,25*0,5)=17,6.106 diploïdes

Il faut aussi prendre en compte la sous-représentation des diploïdes issus du croisement de BLT15 avec des mutants à croissance ralentie (à effet dominant) ou des mutants de conjugaison, la non-prise en compte des haploïdes prototrophes pour la lysine et la méthionine (un quart des haploïdes), ainsi que la viablilité des spores, qui est bien sûre très hétérogène selon les mutants. Au final, 30 millions de diploïdes par groupe seront mis à sporuler.

3.4 Sélection des suppresseurs de la toxicité de RAD53-DL

Chez la levure S. cerevisiae, les 4 spores haploïdes issues de la méiose sont emprisonnées au sein d’un asque, structure rigide dont l’éclatement entraîne la libération des spores qui pourront alors germiner et reprendre leur cycle de croissance végétative. Un traitement post- sporulation des cellules avec de la zymolyase, un enzyme permettant la lyse des parois cellulaires des levures, a été envisagé afin de fragiliser les asques et libérer davantage de spores. Nous avons en fait constaté une baisse de la viabilité des spores, la zymolyase s’attaquant outrageusement à leur paroi dans les conditions testées ! Après 8 jours de sporulation, les cellules seront donc directement étalées sur un milieu riche YPD contenant de la généticine (sélection de la délétion) et de la nourséothricine (sélection de RAD53-DL), en absence de doxycyline. Ainsi, seuls seront sélectionnés les mutants haploïdes (Mat!) pouvant tolérer l’expression de RAD53-DL – en tout cas seront-ils les premiers à pousser. En effet, la souche BLT15 présentant une certaine croissance résiduelle en absence de doxycycline, même les souches incapables de supprimer la toxicité de RAD53-DL finiront par apparaître. Il faut donc définir une « fenêtre temporelle » d’isolement des suppresseurs. Pour ce faire, la souche appât BLT15 sera croisée avec les souches BY4741 rad9" et BY4741 ura2", en lieu et place d’un groupe de mutants. L’apparition des clones RAD53-DL rad9" marquera ainsi approximativement le début de la « récolte » des suppresseurs, celle des colonies RAD53-DL

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Un deuxième milieu de sélection a également été utilisé. Il diffère du premier par l’ajout de camptothécine à la concentration de 1µg/mL. Ce milieu plus stringent devrait permettre à la fois de supprimer presque totalement la croissance résiduelle de la souche BLT15, mais aussi de révéler des interactions induites par un stress génotoxique. 50% des cellules seront étalées après sporulation sur chacun de ces milieux.

3.5 Contrôles du crible

Plusieurs contrôles sont nécessaires pour s’assurer du bon déroulement du crible en conditions réelles. En plus de définir la « fenêtre temporelle » d’isolement des suppresseurs, les croisements de la souche appât BLT15 avec les souches BY4741 rad9" et BY4741 ura2" serviront respectivement de contrôles positif et négatif du crible. Toujours dans les conditions du crible, 30 millions de diploïdes BLT15xBY4741 ura2" seront mis à sporuler et étalés sur le milieu de sélection YPD+généticine+nourséothricine, mais cette fois en présence de doxycycline. Ce contrôle permettra d’estimer le nombre maximal de clones détectables dans les conditions du crible (en plus de l’absence de toxicité de RAD53-DL, le mutant ura2! ne présente pas de défauts notables de croissance, viabilité, conjugaison, sporulation ou germination), et de vérifier qu’il est compatible avec nos estimations.

3.6 Biais du crible

L’utilisation de la banque de délétants EUROSCARF pour notre crible implique par définition que les gènes essentiels chez S. cerevisiae ne seront pas représentés. Les mutants de conjugaison ou de germination seront eux pratiquement exclus – de même que les mutants dominants de méiose/sporulation. L’hétérogénéité des mutants rassemblés au sein d’un des 43 groupes sera, malgré toutes les précautions prises, à l’origine d’une sous-représentation des souches dont la croissance est ralentie. Les délétions liées génétiquement à TRP1 – c’est à dire situées à moins de 50cM du locus TRP1 où est inséré RAD53-DL-P!NATMX4 – ne pourront être associées à RAD53-DL qu’après crossing-over, soit avec une faible fréquence. Enfin, les hasards de la génétique seront source de quelques désagréments, particulièrement les mutations inactivant RAD53-DL qui donneront de faux positifs, et donc de faux espoirs. Surtout, le crible est basé sur l’apparition de clones dans une fenêtre temporelle donnée du fait de la croissance résiduelle de la souche BLT15 en absence de doxycycline. Des mutations supprimant potentiellement la toxicité de RAD53-DL mais affectant par trop la croissance de la souche seront donc irrémédiablement ignorées. Nobody’s perfect !