Formation du protéasome 26S 1 Association 19S-20S

Un prérequis à la dégradation des protéines polyubiquitinylées par le protéasome 26S est évidemment la formation du dit protéasome, c’est à dire l’association de la partie catalytique 20S avec le complexe régulateur 19S. Dès les premières études, il est apparu que les deux composants du « complexe multiprotéique de dégradation des protéines ubiquitinylées », le CP et la RP, s’assemblent de façon ATP-dépendante in vitro (Ganoth et al, 1988). Depuis, de nombreux travaux ont démontré que la formation de protéasomes 26S in vitro à partir de 20S et 19S purifiés demande de l’ATP (par exemple (Hoffman et al, 1992; DeMartino et al, 1994)). Une étude récente a précisé que la liaison de l’ATP est nécessaire et suffisante in vitro à l’assemblage du protéasome 26S mammifère, ainsi qu’à sa stabilité (Liu et al, 2006).

In vivo, des facteurs tels que le chaperon Hsp90 (Imai et al, 2003) régulent l’association 19S-

20S et la stabilité du 26S. La protéine Ecm29 fait elle-aussi figure de candidat à l’assemblage du 26S. Ecm29 est un composant accessoire du protéasome, une protéine de grande taille (210kDa) qui semble attacher la RP au CP chez S. cerevisiae et stabiliser le 26S (Leggett et al, 2002; Kleijnen et al, 2007). Néanmoins, un rôle différent « d’adaptateur » permettant de recruter le protéasome 26S vers différents compartiments intracellulaires a été proposé pour l’homologue mammifère d’Ecm29 (Gorbea et al, 2004).

Selon Fujimuro et al., des niveaux plus élevés de protéasome sont détectés en phase stationnaire par rapport à la phase exponentielle de croissance chez S. cerevisiae ; le passage de la phase de croissance à la phase stationnaire favorise également l’association du 19S et du 20S et les configurations RP2-CP (Fujimuro et al, 1998a). Des résultats en parfaite

contradiction avec les travaux de Bajorek et al. qui suggèrent que le protéasome 26S de la levure est désassemblé en 20S et 19S en phase stationnaire, une dissociation corrélée à la baisse de l’activité protéolytique des cellules (Bajorek et al, 2003). Chez les mammifères, la phosphorylation de la sous-unité de la base Rpt6 semble favoriser son interaction avec "2 et l’assemblage du 26S. In vitro, le traitement à la phosphatase alcaline du 26S entraîne quant à lui sa dissociation en 19S et 20S (Satoh et al, 2001). La phosphorylation d’"7 semble elle aussi importante pour l’association 19S-20S (Rivett et al, 2001). Enfin, il a été suggéré que la présence d’un substrat en cours de dégradation stabilise le protéasome 26S de façon allostérique, ce qui favoriserait la processivité de la protéolyse (Kleijnen et al, 2007).

3.5.3.2 Dissociation 19S-20S

En plus de son rôle dans l’assemblage, l’ATP retarde la dissociation du 26S en sous- complexes CP et RP (Coux et al, 1996; Voges et al, 1999).

10 _{Des complexes base-CP ont été détectés dans le mutant rpn10}

" (Glickman et al, 1998a) et certains mutants du

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PAAF1, un facteur régulant négativement l’association RP/CP chez les mammifères, a été identifié récemment. PAAF1 interagit spécifiquement avec les ATPases de la base du 19S et inhibe l’activité du protéasome 26S en empêchant l’assemblage 19S-20S et/ou en favorisant la dissociation des complexes 26S en 19S et 20S (Park et al, 2005; Lassot et al, 2007). La protéine Rpn14 de S. cerevisiae, d’abord considérée comme une nouvelle sous-unité potentielle de la RP (Samanta & Liang, 2003) semble être un homologue de PAAF1 (Park et al, 2005).

Figure I 30. Modèle d’assemblage du complexe régulateur 19S chez S. cerevisiae

Le couvercle et la base sont assemblés indépendamment dans le cytoplasme et importés indépendamment dans le noyau, où ils s’associent pour former le complexe régulateur 19S. Rpn10 (en rouge) se situe à l’interface entre la base et le couvercle et stabilise leur association. Isono et al. ont proposé que la base s’associe tout d’abord avec le protéasome 20S, puis que le couvercle s’assemble au complexe base-20S pour former le protéasome 26S (non représenté). Les représentations de la base et du couvercle proposées ici sont essentiellement conceptuelles.

Babbitt et al. ont montré qu’une dissociation contrôlée du 19S à partir du 26S pourrait participer au processus de dégradation (Babbitt et al, 2005). Ils ont en effet observé sur des protéasomes 26S purifiés que l’hydrolyse de l’ATP déclenche le démembrement du 19S en base, couvercle et Rpn10 libre. De plus, la dégradation du substrat semble essentielle à cette dissociation, qui permettrait ainsi la sortie des produits de clivage. Ces données apparaissent passablement contradictoires avec le modèle de Kleijnen et al. où le processus de dégradation réduit au contraire le désassemblage du 26S (Kleijnen et al, 2007).

3.5.3.3 Localisation du 26S

La régulation de la localisation du protéasome est cruciale pour son fonctionnement. Chez la levure, le protéasome est enrichi dans le noyau et l’enveloppe nucléaire (voir paragraphe 3.5.1.4). Sa distribution entre le cytoplasme et le noyau est plus homogène chez les eucaryotes supérieurs (Reits et al, 1997) ; dans certaines cellules, le ratio de protéasomes

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cytoplasmiques/nucléaires varie au cours du cycle cellulaire (Amsterdam et al, 1993; Palmer et al, 1994; Lafarga et al, 2002). Nous avons déjà vu qu’il existe une coordination étroite entre l’assemblage du 20S et du 19S et leur importation nucléaire chez la levure (voir paragraphes 3.5.1.4 et 3.5.2.4). Un facteur semble également contrôler la localisation nucléaire du protéasome 26S, la protéine Cut8/Sts1 (chez S. pombe/S. cerevisiae) (Tatebe & Yanagida, 2000; Takeda & Yanagida, 2005). Ainsi, dans un mutant cut8, le protéasome 26S est majoritairement cytoplasmique (Tatebe & Yanagida, 2000). Cut8 interagit physiquement avec les sous-unités du 20S et du 19S in vitro et in vivo, une interaction favorisée par l’ubiquitinylation de Cut8, qui est de plus nécessaire à l’enrichissement nucléaire du 26S (une forme non-ubiquitinylable de Cut8 dont toutes les lysines ont été mutées en arginines ne permet pas l’enrichissement nucléaire du 26S) (Takeda & Yanagida, 2005). L’ubiquitinylation de Cut8 dépend de l’E2 Rhp6 (associé aux E3 Ubr1 et Rhp18) et, logiquement, l’interaction du protéasome avec Cut8 et sa localisation nucléaire sont abolies dans un mutant rhp6". Enfin, la protéine Cut8 a une distribution cellulaire très proche mais indépendante de celle du protéasome. L’ensemble de ces données indique que la forme ubiquitinylée de Cut8 ancre le protéasome 26S (plutôt que ses sous-complexes ou des formes précurseurs) à l’intérieur du noyau. La dégradation de Cut8 par le protéasome permettrait alors son exportation dans le cytoplasme. Un système de rétrocontrôle négatif qui assure une régulation très fine de l’accumulation du 26S dans le noyau, requise notamment quand des protéines nucléaires abondantes doivent être détruites. Un homologue de Cut8/Sts1 a été identifié chez la drosophile (Takeda & Yanagida, 2005).

La protéine Yin6, parfois considérée comme un importateur nucléaire du couvercle (voir paragraphe 3.5.2.4.2) pourrait être, au même titre que Cut8, un régulateur de la localisation et de la fonction du protéasome 26S (Yen et al, 2003). L’inactivation de Yin6 entraîne ainsi la mort des mutants cut8 ; Yin6/Int6 se lie directement à Rpn5, mais une interaction avec le protéasome 26S dans sa globalité est aussi détectée in vivo. Enfin, seule la localisation de Rpn5 a été étudiée dans le mutant yin6", ce qui n’empêche nullement que la localisation des autres sous-complexes du 26S soit aussi perturbée (généraliser au protéasome 26S un résultat obtenu pour une seule de ses sous-unités est par ailleurs un des biais de nombreuses études sur le protéasome, même s’il a désormais tendance à s’estomper).

Récemment, une relocalisation massive des sous-unités du protéasome au sein de structures cytoplasmiques appelées PSG (Proteasome storage granules) dans les cellules quiescentes a été décrite chez les levures S. cerevisiae et S. pombe. Ces granules serviraient de « réservoirs » de protéasomes rapidement mobilisés lors de la reprise du cycle cellulaire (Laporte et al, 2008).