Analyse des bases de données et groupes fonctionnels

La quantité d’informations fournies par les bases de données est proprement gigantesque. Outre, évidemment, la fonction d’un gène donné, sa séquence, les phénotypes du mutant, les caractéristiques physico-chimiques de la protéine encodée, etc., elles recensent également toutes les interactions génétiques et physiques connues. Constamment alimentées par des cribles à haut débit toujours plus sensibles, ces dernières permettent de construire facilement le réseau d’interaction du gène d’intérêt. Le site http://string.embl.de/ propose par exemple de visualiser ces interactions de façon particulièrement rapide, pratique et esthétique.

Nous poursuivons deux buts : premièrement, rapprocher les suppresseurs avec la voie des checkpoints et, plus généralement, avec la réponse aux dommages de l’ADN. Dans cette optique, en plus de la fonction du suppresseur, ses éventuelles interactions génétiques ou physiques avec des composants de la DDR, ou encore des phénotypes de sensibilité aux stress génotoxiques, ont été tout particulièrement surveillés. Deuxièmement, il nous faut rapprocher les gènes suppresseurs entre eux ; de la même façon, l’analyse de leurs interactions génétiques et physiques est venue compléter les données fonctionnelles disponibles. L’étude des bases de données disponibles pour S. cerevisiae (principalement Saccharomyces Genome Database : www.yeastgenome.org/ et YPD : https://www.proteome.com/proteome/) a ainsi permis d’établir une première classification et de rassembler de nombreux gènes au sein de groupes fonctionnels (tableau RI 1). 30% des suppresseurs n’ont pas de fonction connue, soit autant de nouveaux acteurs potentiels de la voie des checkpoints de l’ADN. Les autres gènes sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires telles que le remodelage de la chromatine, la réponse au stress ou la trancription (tableau RI 2), suggérant un large spectre d’action de Rad53. Notre crible a également isolé plusieurs voies de signalisation et des complexes protéiques déjà décrits mais qui n’avaient jamais été reliés à Rad53 jusqu’alors. Quelques exemples sont détaillés ci-dessous.

Enfin, en comparant nos suppresseurs avec les membres du réseau d’interactions physiques de Rad53 (voir figure I 12), nous n’avons identifié aucun facteur commun. Ce qui démontre la complémentarité des approches « interactions génétiques » et « interactions physiques » (ou alors que nous avons isolé n’importe quoi !). Des interactions labiles ou se produisant uniquement sous certaines conditions pourraient ainsi être révélées plus facilement in vivo par une approche génétique.

6.1.1 Voie HOG du stress osmotique

Le gène PBS2, qui code une MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) kinase impliquée dans le stress osmotique, représente à lui seul le cinquième des suppresseurs ! La cible de Pbs2, la MAPK Hog1, a également été retrouvée 7 fois dans le crible. SSK1, un troisième composant de cette voie de transduction, fait lui aussi partie des suppresseurs (pour une revue sur la voie HOG de réponse au stress osmotique, (Hohmann, 2002)) (figure RI 11A).

Les liens entre la voie HOG et les checkpoints de l’ADN semblent donc particulièrement dignes d’intérêt. Rad53 et Hog1 ont d’ailleurs déjà fait l’objet d’une étude commune en

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réponse au peroxyde d’hydrogène, un stress oxydatif qui entraîne la phosphorylation des deux protéines (Haghnazari & Heyer, 2004). Cette étude a cependant conclu à l’indépendance des 2 voies dans ce contexte.

On peut remarquer que ces 2 voies de transduction, qui impliquent majoritairement des protéines kinases, sont régulées par des phosphatases communes, en particulier Ptc2 et Ptc3 (Leroy et al, 2003; Saito & Tatebayashi, 2004), médiateurs possibles d’une interconnexion entre les 2 voies. Une autre hypothèse, moins favorable, serait qu’en absence de Pbs2 ou Hog1, Ptc2 et Ptc3, libérées de deux de leurs substrats, pourraient plus fortement inactiver

RAD53-DL et donc supprimer, en partie, sa toxicité. Une suppression artefactuelle, sans réelle

existence physiologique. Tester si la délétion de PTC2/PTC3 dans les souches RAD53-DL

hog1! ou RAD53-DL pbs2! abolie la suppression de RAD53-DL répondrait à cette question.

Quoiqu’il en soit, HOG1 a été le premier suppresseur identifié. Et c’est sans attendre, sans a

priori, que nous avons commencé son étude. La croissance de la souche BLT15 a tout

d’abord été testée en présence de doses croissantes de NaCl ou de sorbitol, induisant un stress osmotique. Nous avons observé que l’expression de RAD53-DL sensibilise les cellules à ces deux stress (figure RI 11B). Nous avons alors mesuré l’activation de Rad53/Rad53-DL en présence d’un stress osmotique, et observé une suractivation de RAD53-DL suite à l’addition de NaCl. De plus, cette suractivation dépend de HOG1 (figure RI 11C).

Catégorie Nombre de gènes

Réponse aux dommages de l'ADN 2 Régulation du cycle cellulaire 2 Remodelage de la chromatine 7

Signalisation 3

Réponse au stress 5

Transcription 5

Métabolisme des ARNm 6

Export des ARNm 2

Structure cellulaire 3

Trafic intracellulaire 3

Repliement des protéines 2

Protéasome 3

Métabolisme cellulaire 18

Métabolisme mitochondrial 8

Autres 11

Fonction inconnue 30

Tableau RI 2. Répartition des suppresseurs selon leur fonction cellulaire

Une littérature documentant les dommages de l’ADN induits par le sel existe, notamment pour les cellules de mammifères exposées à des milieux hypertoniques (par exemple, (Dmitrieva et al, 2004)). Avant d’aller plus loin, un point, cependant, a attiré notre attention : dans ces expériences, contrairement à Rad53-DL, la protéine endogène Rad53 ne semble pas affectée par l’ajout de sel. Le Dr A. Peyroche a alors suggéré que l’opérateur TetO contrôlant l’expression de RAD53-DL pourrait être affecté par la présence de NaCl. Hypothèse immédiatement testée et… vérifiée en transformant une souche sauvage et une souche hog1! avec le plasmide pCM183-GFP (c’est à dire portant le gène codant la GFP placé sous le contrôle de l’opérateur tétracycline TetO). Dans ces conditons, en effet, l’ajout de NaCl induit

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l’expression de la protéine GFP, et ce dans les mêmes proportions que l’absence de doxycycline (l’absence de doxycycline conjuguée à la présence de sel n’augmentant pas l’expression de la GFP, il semble que l’un ou l’autre de ces stimuli, aux concentrations utilisées, soit suffisant pour atteindre le niveau maximal d’expression permis par l’opérateur TetO). De plus, comme pour RAD53-DL, l’effet du sel est aboli en absence de Hog1 (figure

RI 11D).

A. B.

C. D.

Figure RI 11. RAD53-DL et la voie HOG de réponse au stress osmotique

A. Schéma de la voie HOG de réponse au stress osmotique. Adapté de (Hohmann, 2002). Les gènes SSK1, PBS2 et HOG1 (en rouge) ont été identifiés dans le crible de suppression de la toxicité de RAD53-DL.

B. Sensibilité de BLT15 au stress osmotique. Des dilutions sériées des souches BLT12 et BLT15 ont été spottées sur des boîtes contenant le milieu de culture YPD seul ou additionné de NaCl (0,5M) ou de sorbitol (0,8M) en conditions permissives (+Dox) ou en conditions restrictives (-Dox). Les cellules ont été incubées 2 jours à 30°C. C. Induction de Rad53-DL en réponse au stress osmotique. Des extraits protéiques totaux réalisés à partir de souches BLT12, BLT15, hog1! et RAD53-DL hog1! cultivées en conditions permissives (+Dox) ou restrictives

(-Dox), en absence (-) ou en présence (+) de NaCl (0,75M) ont été analysés par Western blot avec des anticorps anti-Rad53.

D. Induction de la GFP en réponse au stress osmotique et à la doxycycline. Des extraits protéiques totaux réalisés à partir de souches sauvage HOG1 ou mutante hog1! transformées avec le plasmide pCM183-GFP et cultivées en absence (-) ou en présence (+) de doxycycline et de NaCl (0,75M) ont été analysés par Western blot avec des anticorps anti-GFP.

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Le crible de suppression de la toxicité de RAD53-DL n’a bien entendu pas été effectué en présence de 1M NaCl. Il n’empêche, ces observations nous ont fait attendre le résultat des autres réactions de séquençage avec encore plus d’impatience.

6.1.2 Métabolisme de l’ARN

Plusieurs suppresseurs forment un groupe cohérent ayant trait au métabolisme des ARN messagers.

6.1.2.1 Nonsense-mediated mRNA decay

Le nonsense-mediated mRNA decay (NMD) est un mécanisme de surveillance qui reconnaît et dégrade rapidement les ARNm contenant des codons stop prématurés (Baker & Parker, 2004). Il régule également une fraction importante du transcriptome (He et al, 2003). Les trois composants majeurs du NMD chez S. cerevisiae, NAM7 (UPF1), NMD2 (UPF2) et UPF3 ont été identifiés dans notre crible. De même que l’absence de l’une ou l’autre de ces trois protéines entraîne les mêmes perturbations du taux de dégradation des ARNm, la suppression de toxicité de RAD53-DL dans les souches nam7!, nmd2! et upf3! est identique (figure RI

12A). Il semble donc que l’inactivation du NMD soit à l’origine de la suppression de la

toxicité de RAD53-DL.

A. B.

Figure RI 12. Effet suppresseur de RAD53-DL et résistance au stress génotoxique des mutants du NMD

A. Suppression de la toxicité de RAD53-DL par les mutants du NMD. Des dilutions sériées des souches BLT12, BLT15, RAD53-DL nam7", RAD53-DL nmd2" et RAD53-DL upf3" ont été spottées sur milieu YPD en conditions permissives (+Dox) ou restrictives (-Dox). Les cellules ont été incubées 2 jours à 30°C.

B. Résistance au 4NQO des mutants du NMD. Des dilutions sériées des souches sauvage (WT, wild type),

nam7", nmd2", upf3" et des différentes combinaisons de double mutants ont été spottées sur milieu YPD seul

ou additionné de 4NQO (0,4µg/mL). Les cellules ont été incubées 2 jours à 30°C.

Chez les eucaryotes supérieurs, l’état de phosphorylation d’Upf1, crucial pour le NMD, est finement régulé (Stettler et al, 1993; Page et al, 1999). Une étude récente a démontré que les protéines Upf1 et Upf2 de S. cerevisiae sont des phosphoprotéines (Wang et al, 2006). Cependant, alors que les protéines responsables de la phosphorylation et de la déphosphorylation d’Upf1 sont connues aussi bien chez l’Homme que chez le nématode, ces facteurs n’ont pas encore été identifiés chez la levure. Parmi les candidats, les phosphatidylinositol-3-related kinases (PI3-kinases) Mec1 et Tel1. Il a d’ailleurs été montré qu’hUpf1 est phosphorylée in vitro et in vivo par ATR (l’homologue de Mec1 chez l’Homme)

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et qu’il est nécessaire à la stabilité du génome, mais ce de façon curieusement indépendante de son rôle dans le NMD (Azzalin & Lingner, 2006).

Enfin, parmi les gènes de levure dont l’expression est contrôlée au niveau post- transcriptionnel par le NMD, plusieurs sont impliqués dans les checkpoints (TEL1, MEC3) ou la réparation de l’ADN (RAD1, YKU70) (He et al, 2003). Chez la drosophile, ATM est également régulé par le NMD (Rehwinkel et al, 2005). Les checkpoints de l’ADN comme cibles du NMD, ou bien le NMD comme cible des checkpoints de l’ADN ?

6.1.2.2 Polyadénylation de l’ARN

Le gène PAB1, codant la protéine de liaison à la queue poly(A) des ARNm (Sachs et al, 1986), est un suppresseur multicopie de RAD53-DL (A. Peyroche, données non publiées). Notre crible a isolé trois gènes, SXM1, PBP1 et PAN2 liés au mécanisme de polyadénylation des pré-ARNm. Sxm1 est un transporteur nucléaire de type karyophérine qui assure l’import nucléaire de Pab1 (Brune et al, 2005). Pbp1 est un facteur de contrôle de la polyadénylation qui régule négativement Pab1, avec lequel il interagit en double-hybride (Mangus et al, 1998). Enfin, Pan2 est la sous-unité catalytique du complexe poly(A)-ribonucléase PAN dont l’activité de déadénylation dépend de Pab1 (Sachs & Deardorff, 1992).

PAN2, identifié 7 fois dans notre crible, a également été impliqué dans la DDR, plus

précisément dans la réponse au blocage de la réplication. Le complexe PAN contribue, avec la protéine kinase Dun1, à la régulation post-transcriptionnelle du gène de réparation de l’ADN Rad5 (Hammet et al, 2002). Dans le modèle proposé, l’absence de DUN1 et de PAN2 empêche le maintien de l’activation du checkpoint de la phase S. Ce mécanisme est probablement à l’origine de la suppression de RAD53-DL.

6.1.2.3 NMD et polyadénylation

Le rôle de Pab1 dans le NMD est âprement discuté, certains lui attribuant un rôle-clé permettant de discriminer les codons STOP prématurés des « vrais » codons STOP chez la levure (Amrani et al, 2004), alors que d’autres le trouvent parfaitement dispensable au NMD (Meaux et al, 2008).

Des liens complexes mais étroits existent donc entre le NMD et la maturation des ARN messagers (figure RI 13). Il serait intéressant de déterminer (par des tests d’épistasie, voir ci- dessous) si la suppression de RAD53-DL par les mutants du NMD et ceux de la polyadényation des ARNm dépend d’un mécanisme commun, avant d’étudier plus avant les relations éventuelles entre Rad53 et le métabolisme des ARN messagers. Tester a posteriori l’effet suppresseur des autres membres de ce réseau d’interaction permettrait également de renforcer l’intérêt d’une telle étude.

6.1.3 OCA1, YHL029C et YCR095C

Des interactions physiques entre Oca1, Yhl029c et Ycr095c ont été détectées à la fois au sein de cribles double-hybride (Ito et al, 2001) et de purification par affinité couplée à une analyse par spectrométrie de masse (Gavin et al, 2006). De plus, les 3 gènes ont été identifiés dans un crible génétique comme étant nécessaires à la réplication du virus de la mosaïque du brome chez S. cerevisiae (Kushner et al, 2003). Oca1 ressemble à une tyrosine phosphatase, et présente 2 homologues chez S. cerevisiae, Siw14 et Ynl056w. Ycr095c est également un membre de la famille des tyrosine phosphatases, et partage 23% d’identité avec Oca1, 25% avec Siw14. La protéine Oca1 est impliquée dans l’arrêt du cycle cellulaire en G1 en réponse

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au stress oxydant (Alic et al, 2001). Les checkpoints de l’ADN sont également activés suite à un stress oxydant (Leroy et al, 2001), mais des interconnexions avec la voie OCA1 restent à révéler.

Figure RI 13. Interactions entre le NMD et la polyadénylation des ARN. Réalisé sur http://string.embl.de/

L’épaisseur du trait reliant 2 gènes rend compte de la probabilité de l’interaction.

6.1.4 Protéasome

Trois gènes codant des composants de la voie du protéasome figurent parmi les suppresseurs :

UMP1, PRE9 et SEM1. Ce groupe comprend en fait la quasi-totalité des gènes du protéasome

susceptibles d’être isolés dans notre crible, l’écrasante majorité des gènes codant les sous- unités du protéasome étant essentiels. Les liens entre le protéasome et la réponse aux dommages de l’ADN sont discutés dans la… discussion.

6.1.5 Conclusion

L’étude conjointe de la littérature et des bases de données disponibles pour S. cerevisiae a permis d’identifier plusieurs réseaux d’interactions et de répartir plusieurs gènes en groupes fonctionnels. Ces groupes nous renseignent sur le possible mécanisme à l’origine de la suppression de RAD53-DL et donc sur l’approche à adopter pour analyser ce mécanisme. Surtout, ils permettent d’évaluer l’intérêt d’une telle analyse.

D’autres suppresseurs ont été rassemblés sur la base d’un processus cellulaire « général » commun, tels que la transcription, l’activité mitochondriale… Les liens qui les unissent sont beaucoup plus lâches, le mécanisme à l’origine de la suppression de RAD53-DL probablement différent pour chaque suppresseur. Enfin, comme dans tout crible, plusieurs gènes avec des fonctions aussi diverses qu’inattendues ont été isolés. Leur pertinence physiologique n’en est pas nécessairement moindre, mais la stratégie à envisager pour leur étude est peu évidente. Les bases de données étant en constante évolution, des interactions entre ces différents suppresseurs ne manqueront pas de se faire jour.

En attendant, deux possibilités s’offrent à nous : soit étudier spécifiquement un des groupes fonctionnels, soit pousser plus avant l’analyse de la totalité des suppresseurs à travers des cribles secondaires pour (i) déterminer leur implication dans la voie de réponse aux dommages à l’ADN, (ii) identifier de nouvelles interactions permettant de définir de

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nouveaux groupes fonctionnels et (iii) définir leurs interactions avec Rad53. Nous avons choisi de continuer dans un premier temps l’analyse globale de tous les suppresseurs.

6.2 Analyse phénotypique des suppresseurs et implication des suppresseurs dans la