Activation du protéasome 20S

3.6.2.1 Fermeture du pore axial du protéasome 20S

Le protéasome 20S eucaryote isolé est catalytiquement quasi inerte. Son activation, c’est à dire sa capacité à dégrader des peptides et des protéines dépliées, requiert dans l’immense majorité des cas l’association avec un complexe régulateur. Cet état « auto-inhibé » est lié à l’obstruction physique des pores axiaux conduisant à la chambre protéolytique par la projection des queues N-terminales (en amont des hélices H0) des sous-unités " (Groll et al, 1997). La sous-unité "3 semble particulièrement importante dans la formation de cette « porte » fermant le pore du 20S : sa queue N-terminale s’étend en travers du pore du CP et interagit avec les extensions N-terminales de l’ensemble des autres " formant l’occlusion. Chez S. cerevisiae, la délétion des 9 acides aminés N-terminaux d’"3 (!3"N) provoque une désorganisation structurale majeure et « ouvre » le canal vers la chambre catalytique, déréprimant l’activité peptidase du 20S (Groll et al, 2000). Les contacts directs formés entre les sous-unités " adjacentes impliquent les résidus d’un motif YDR (Tyr8-Asp9-Arg10) conservé au sein des extensions N-terminales des ". Ce motif joue un rôle essentiel dans la stabilisation de l’état fermé du canal (Groll et al, 2000; Forster et al, 2003; Smith et al, 2006).

3.6.2.2 Mécanisme d’ouverture du protéasome 20S

L’activité peptidase de 20S !3"N purifiés est similaire à celle des protéasomes 26S purifiés à partir de la souche mutante ou d’une souche sauvage. Ainsi, la formation du protéasome 26S active le CP d’une façon comparable à la délétion de la queue N-terminale d’"3, ce qui indique que la dérepression du 20S par le 19S implique l’ouverture de la « porte » du pore formée par les queues N-terminale des " (Groll et al, 2000). Afin de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent, des modèles d’activation plus simples ont été étudiés.

Introduction / Le protéasome 26S : assemblage et fonctionnement

3.6.2.2.1 Ouverture du protéasome 20S par PA28

Chez certains eucaryotes, l’activité peptidase du 20S est fortement stimulée par le complexe régulateur PA28 (voir paragraphe 3.3.4). Un modèle d’ouverture du pore du CP par PA26, l’homologue trypanosome de PA28, a été proposé. L’association du complexe heptamérique PA26 avec le 20S requiert les extrémités C-terminales des sous-unités de PA26 (Ma et al, 1993) et l’étude par cristallographie de la structure d’un protéasome chimère composé de PA26 de Trypanosoma brucei et du 20S de S. cerevisiae a montré que ces extrémités se fixent dans de petites « poches » entre les sous-unités " adjacentes (Whitby et al, 2000). Ces interactions sont suffisantes pour la liaison PA26/20S mais pas pour l’activation du protéasome (Zhang et al, 1998). Les sous-unités de PA26 contiennent chacune un deuxième domaine dit domaine d’activation qui interagit avec les résidus N-terminaux des sous-unités " et, ce faisant, induit un changement de structure faisant passer la « porte » du pore d’une conformation asymétrique fermée à une conformation symétrique ouverte (Whitby et al, 2000; Forster et al, 2003). D’aucuns ont proposé que le mécanisme d’ouverture du 20S par le 19S soit similaire (Forster et al, 2005). Cependant, une différence fondamentale entre PA28/26 et le 19S sème le doute : PA28/26 a une structure heptamérique, qui lui permet d’imposer sa symétrie d’ordre 7 à l’anneau " du 20S, un processus fondamental dans son activation (Whitby et al, 2000; Forster et al, 2003). La structure hexamérique des Rpt de la base de la RP semble difficilement conciliable avec un tel mécanisme.

3.6.2.2.2 Ouverture du protéasome 20S par le 19S

De nombreuses réponses sur l’activation du 20S eucaryote par le 19S ont été fournies par l’étude du complexe ATPase PAN (Proteasome-activated nucleotidase) de l’archébactérie M.

jannaschii (figure I 32). PAN forme un anneau hexamérique constitué de 6 sous-unités AAA

ATPases PAN identiques (Zwickl et al, 1999). PAN est l’homologue connu le plus proche des ATPases eucaryotes du 19S, partageant plus de 40% d’identité de séquence avec les 6 Rpt (Smith et al, 2006).

Smith et al. ont montré que PAN et trois des 6 Rpt (Rpt2, Rpt3 et Rpt5) contiennent un motif C-terminal conservé de 3 résidus HbYX (acide aminé hydrophobe-tyrosine-acide aminé X) (Smith et al, 2007). Ces résidus sont essentiels à l’association de PAN avec le 20S archébactérien et à l’ouverture du pore axial : une fois l’ATP lié par les ATPases, ils interagissent avec des « poches » situées entre les sous-unités " adjacentes (probablement les mêmes que pour PA26) et déclenchent l’ouverture de la porte obstruant le pore axial du 20S. Des polypeptides correspondant à la queue C-terminale de PAN comprenant le motif HbXY se lient au 20S et sont suffisants pour l’activer in vitro. Un système clé/serrure apparemment conservé chez les eucaryotes (figure I 33) : des peptides issus de la queue C-terminale de PAN, de Rpt2 ou de Rpt5 induisent l’ouverture du 20S mammifère in vitro ; de plus, la mutation chez S. cerevisiae du résidu tyrosine du motif HbYX de Rpt2, Rpt3 ou Rpt5 inhibe l’ouverture du 20S (alors qu’elle ne semble pas affecter l’interaction 19S-20S). La mutation ou la délétion des résidus C-terminaux de chaque Rpt du 19S entraîne par ailleurs des altérations spécifiques du protéasome : la mutation de la tyrosine C-terminale de Rpt1 (qui ne fait pas partie d’un motif HbYX) perturbe ainsi très fortement la stabilité du 26S. L’ensemble de ces résultats pointe à nouveau vers un rôle distinct de chaque Rpt, de mieux en mieux caractérisé (Smith et al, 2007).

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Des travaux réalisés par le même laboratoire ont montré que l’interaction des résidus C- terminaux de PAN avec des résidus spécifiques au sein des poches inter-" entraîne la rotation des sous-unités " et le déplacement d’une boucle en dehors du pore, ce qui stabilise la conformation « ouverte » de la porte (Rabl et al, 2008). Cette conformation ouverte semble être similaire à celle induite par PA26 (Forster et al, 2005). 2 mécanismes distincts mais un état final similaire.

L’interaction double-hybride des sous-unités Rpt du 19S avec plusieurs sous-unités " pourrait trouver dans le système clé/serrure d’ouverture du 20S sa justification (voir paragraphe 3.3.4.2.4). Cependant, il est évident que les 6 extrémités C-terminales de PAN/des Rpt ne peuvent pas contacter simultanément les 7 poches inter-". La seule solution est que l’activation du 20S ne requiert la liaison que d’un sous-ensemble des queues C-terminales au sein des interstices entre les sous-unités " (rappelons que le motif HbXY n’est présent que dans 3 Rpt). Une association asymétrique flexible en accord avec les observations par microscopie électronique suggérant une certaine mobilité du 19S par rapport au 20S (Walz et al, 1998) (voir paragraphe 3.3.4.1). Comme d’autres membres de la famille des AAA ATPases, PAN et les Rpt subissent des changements conformationnels majeurs ATP- dépendants indissociables de leur activité de dépliement et de translocation du substrat (Smith et al, 2007). Le mécanisme clé/serrure et l’association flexible du 19S avec le 20S apparaissent ainsi particulièrement adaptés au fonctionnement hautement dynamique de ces complexes ATPasiques.

Enfin, il a été suggéré très récemment que les sous-unités non-ATPasiques de la base Rpn1 et Rpn2 participent à l’ouverture du 20S (Rosenzweig et al, 2008).

Figure I 32. Comparaison des images par microscopie électronique des complexes PAN- protéasome 20S de M. jannaschii et protéasome 26S de Xenopus laevis. Extrait de (Smith et al, 2006)

Le complexe PAN et les 6 Rpt du 19S eucayote sont colorés en orange.

3.6.2.2.3 Couplage assemblage/ouverture ?

Un dernier point mérite d’être soulevé : contrairement au complexe PA26-20S pour lequel les étapes d’association et d’activation sont clairement séparables, l’association de PAN avec le 20S et son activation semblent intrinsèquement liées (Smith et al, 2005; Smith et al, 2007). D’autres travaux ont montré que l’association 19S-20S et l’activation du 26S eucaryote sont temporellement inséparables, mais plusieurs résultats suggèrent un découplage : la mutation du résidu tyrosine du motif HbYX de Rpt2, Rpt3 ou Rpt5 chez S. cerevisiae inhibe l’ouverture du 20S mais ne semble pas affecter l’interaction 19S-20S (Smith et al, 2007) ; la vitesse de désassemblage en absence d’ATP est plus lente que la perte d’activité

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protéolytique, et l’ATP peut stimuler l’activité de protéasomes 26S déjà assemblés (Liu et al, 2006). Il est ainsi possible que la liaison de l’ATP à certains domaines ATPasiques soit suffisante pour l’assemblage du 26S, et que la liaison de l’ATP à d’autres domaines soit plus particulièrement impliquée dans l’activation (Liu et al, 2006). Il était connu chez la levure qu’une mutation au sein du domaine de liaison à l’ATP de Rpt2 (rpt2RF) entraîne une perte d’activité peptidase du 26S (Rubin et al, 1998). Kölher et al. ont montré que le mutant rpt2RF est sauvé par la mutation !3"N qui entraîne l’ouverture constitutive du 20S (Kohler et al, 2001). La liaison de l’ATP au domaine ATPase de Rpt2 semble donc jouer un rôle spécifique dans l’ouverture du 20S, probablement en favorisant l’insertion de la queue C-terminale de Rpt2 au sein des poches inter-".

Chez les eucayotes, l’association du couvercle avec la base stabilise l’interaction de la base avec le 20S (voir paragraphe 3.5.2.4.3). On peut envisager que l’interaction du couvercle avec la base entraîne des changements de conformation des sous-unités Rpt favorisant l’exposition de leurs extrémités C-terminales et/ou leur insertion dans les poches inter-".

3.6.2.2.4 Autres mécanismes d’ouverture du protéasome 20S

En plus des complexes régulateurs 19S, PA28 et PA200, les protéasomes 20S eucayotes peuvent être directement activés par traitment chimique avec de faibles concentrations de détergent SDS (Sodium dodécylsulfate) (Groll et al, 2000), ainsi que par certains peptides hydrophobes – cette ouverture du pore du 20S pourrait correspondre in vivo à un mécanisme facilitant la sortie des produits de clivage du protéasome (Kisselev et al, 2002). Enfin, des protéines intrinsèquement déstructurées (p21cip, caséine, "-synucléine), correspondant à des substrats physiologiques non-ubiquitinylés du protéasome, peuvent également activer le 20S :

in vitro, ces protéines sont efficacement dégradées par le protéasome 20S « latent » alors qu’il

est (presque) incapable d’hydrolyser des petits peptides. Elles possèdent donc certaines caractéristiques leur permettant d’ouvrir le pore du 20S contrôlant l’accès à la chambre protéolytique (Liu et al, 2003). Ce mécanisme suggère des rôles protéolytiques propres au 20S présent sous forme libre in vivo. La dégradation des protéines oxydées par le 20S en est l’illustration (pour une revue, (Davies, 2001)).