Analyse du crible

5.1 Vérification de la suppression de RAD53-DL

5.1.1 Test de croissance en gouttes

Environ 2000 colonies ont été identifiées comme suppresseurs potentiels. Elles ont toutes été repiquées sur milieu riche contenant de la généticine, de la nourséothricine et de la doxycycline, pour les conserver au mieux en vue des analyses futures. Leur capacité à pousser en absence de méthionine ou de lysine a été analysée, et toutes les cellules prototrophes pour ces 2 acides aminés, en tant que potentiels diploïdes, éliminées.

Les quelques 1500 souches restantes ont alors été systématiquement testées en spotting et leur croissance en absence de doxycycline comparée à celle de BLT15 (figure RI 9). Cette méthode d’analyse très fine a révélé trois types de souches. Tout d’abord, des souches dont la croissance est similaire à celle de BLT15, faux suppresseurs issus de la croissance résiduelle. Ensuite, des souches dont la croissance est plus ou moins améliorée par rapport au contrôle ; on a ainsi une gamme de suppression de la toxicité de RAD53-DL qui est le reflet de l’apparition plus ou moins rapide des colonies sur les boîtes de sélection du crible – sans oublier néanmoins que certaines mutations affectent la croissance même en présence de doxycycline. Enfin, un grand nombre de suppresseurs présente une croissance tout à fait comparable à celle d’une souche sauvage, que ce soit en absence ou en présence de doxycycline, comme si la délétion qu’ils renferment pouvait abolir complètement la toxicité de RAD53-DL. Des suppresseurs réellement trop beaux pour être vrais, au sein desquels une mutation a très probablement inactivé RAD53-DL.

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A.

B.

Figure RI 8. Résultats du crible

A. Le crible comme si vous y étiez ! Représentation schématique de l’apparition des colonies sur les boîtes du crible au cours du temps. Les diploïdes résistant à la nourséothricine apparaissent les premiers, suivis des suppresseurs potentiels de la toxicité de RAD53-DL puis des colonies issues de la croissance résiduelle.

B. Résultats du crible. Le pool de délétants n°29 illustre les boîtes obtenues à la fin du crible avec et sans camptothécine. Les boîtes « contrôle » sur lesquelles avaient été étalées les cellules issues des croisements BLT15xBY4741 ura2! (contrôle négatif) ou BLT15xBY4741 rad9! (contrôle positif) sont également

présentées.

5.1.2 Expression de Rad53-DL

Nous avons profité de la présence de la GFP comme constituant de Rad53-DL pour vérifier par microscopie à fluorescence son expression et ainsi discriminer les vrais suppresseurs des révertants. Conformément à nos attentes, aucun signal GFP n’est détecté pour les souches à la croissance similaire à une souche sauvage. Au contraire, un fort signal nucléaire correspondant à Rad53-DL est visible pour les « vrais » suppresseurs (figure RI 9).

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Figure RI 9. Vérification de la suppression de la toxicité de RAD53-DL

Des dilutions sériées des souches BLT12, BLT15 et de différents suppresseurs ont été spottées sur milieu YPD en présence (+Dox) ou en absence de doxycycline, et en présence de CPT (1µg/mL). Les cellules ont été incubées 2 jours à 30°C. L’effet suppresseur des 1500 souches isolées lors du crible a ainsi été systématiquement testé.

Trois types de souches ont été détectés : des suppresseurs, des révertants et des souches présentant un croissance similaire à celle de BLT15 en absence de doxycycline, issues de la croissance résiduelle. Les révertants ont été discriminés des vrais suppresseurs par la visualisation directe de Rad53-DL par microscopie à fluorescence grâce à son étiquette GFP (grossissement X1000).

5.1.3 Sur l’influence de la camptothécine

La suppression de la toxicité de RAD53-DL en présence de camptothécine a également été évaluée (figure RI 9). Tous les suppresseurs issus du crible avec camptothécine améliorent également la croissance de BLT15 en absence de stress génotoxique. Mais même si aucun suppresseur n’est camptothécine-spécifique, l’effet de la drogue n’est pas seulement « linéaire », c’est à dire lié à la seule augmentation de l’activation de RAD53-DL dans ces conditions (figure RI 4C). Dans la majorité des cas l’amélioration de la croissance observée sur milieu riche est bien amoindrie en présence de camptothécine (pourtant à une dose très faible, 1µg/mL, n’affectant pas la croissance d’une souche sauvage), mais cette réduction n’est pas toujours proportionnelle au degré de suppression. Elle est parfois minime, ou au contraire totale. Certains très bons suppresseurs sans CPT sont ainsi pratiquement incapables de supprimer la toxicité de RAD53-DL en présence de la drogue (nous avons bien sûr vérifié que ces suppresseurs ne sont pas eux mêmes sensibles à la CPT). Il semble donc que la camptothécine induise certains stress particuliers permettant de mettre en lumière des rôles et

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des interactions spécifiques de Rad53. En cela, le crible avec camptothécine apporte réellement une information supplémentaire, qui reste certes difficile à interpréter.

5.2 Identification des gènes suppresseurs

Après un nouveau test comparatif de croissance en spotting, 215 suppresseurs ont été validés, allant d’une très faible à une très bonne suppression de la toxicité de RAD53-DL démontrant une bonne couverture et représentativité du crible. L’identification des gènes inactivés au sein de ces souches est rendue aisée par la présence des 2 étiquettes de 20pb situées en amont et en aval de la cassette de résistance KANMX4 et spécifiques de chaque délétion. Pour maximiser l’efficacité des réactions de séquençage, la partie 5’ de la cassette de délétion comprenant l’étiquette amont (UPTAG) a été amplifiée par PCR sur colonie pour chacun des 215 suppresseurs, puis a servi de matrice pour le séquençage (figure RI 10).

En comparant la séquence UPTAG obtenue avec la base de données disponible sur le site du Saccharomyces Genome Deletion Project, on obtient alors – grand moment – le nom du gène invalidé.

Figure RI 10. Identification des suppresseurs

La partie 5’ de la cassette de délétion comprenant l’étiquette amont (UPTAG) a été amplifiée par PCR sur colonie pour chacun des 215 suppresseurs (grâce aux amorces 5’ et 3’ figurées respectivement par les flèches orange et verte), puis a servi de matrice pour le séquençage de l’étiquette UPTAG de 20pb (à l’aide de l’amorce figurée par la flèche verte).