Traitement au laboratoire

Pour chaque individu, la longueur totale (Lt) le poids total (Wt) et éviscéré (We) ont été mesurés en utilisant un ichtyo-mètre au demi-centimètre et une balance avec une précision de 0,01 g. Durant la dissection, les gonades et le foie sont prélevés et pesés (Wg, Wf). Le sexe et la détermination du stade de maturité a été réalisé en se basant sur une échelle de référence de maturité sexuelle. Chez le mâle, l’échelle macroscopique utilisée est celle présentée par Lucio et al. (2000) et ICES (2007) (Tableau 7) et celles des femelles est décrite par Sarano (1986) et amélioré par Recasens et al. (2008) (Tableau 8) en se basant sur la coloration, le volume occupé par la gonade, la tâche sanguine et la présence des ovocytes bien visible cas des femelles matures. Lorsqu’il est difficile de distinguer le sexe des juvéniles, généralement de taille égale ou inférieure à 16 cm, l’individu est considéré dans ce cas comme étant immature ; il est considéré de sexe indéterminé. En se basant sur l’échelle microscopique, nous avons utilisé pour les mâles celle réalisée par Lucio et al. (2000) (Tableau 7) et pour les femelles celle modifiée par Dominguez-Petit et al. (2010) et modifiée par nous-mêmes en séparant le stade IV du stade V (Tableau 8).

39 Tableau 7. Description macroscopique (Lucio et al., 2000 ; ICES, 2007) et microscopique

(Lucio et al., 2000) de la classification de la maturité des testicules pour le merlu.

Stade Description macroscopique Description Microscopique Stade I Juvénile

II En maturation Moyen, large ruban nacré, se coule en le coupant.

Dominance de spermatozoïdes. Ponte III

IV Post-ponte Large bande vide et déformée.

Blanche ou rose, présence ou absence d’un petit résidu.

Vides, des spermatozoïdes en résidu et certaines spermatogonies.

Post-ponte IV

Tableau 8. Description macroscopique (Sarano, 1986; Recasens et al., 2008) et microscopique (Dominguez-Petit et al., 2010 et modifiée par nous) de la classification de la maturité des

ovaires pour le merlu.

Stade Description macroscopique Description Microscopique Stade I Juvénile

Ovocyte de petite taille avec un gros noyau central, la vitellogénèse n’a pas

Présence des alvéoles corticale et / ou toutes les phases de la vitellogénèse et / ou de la phase de migration des noyaux, mais follicules post-ovulatoires ne sont pas présents et aucun signe d’une ponte.

En maturation

II

III Pre-ponte Gonade orangé, occupant la casi-totalité de la cavité abdominale.

Ovocytes sont visibles.

Ponte Capable A III IV Ponte Présence d'ovocytes opaques et

hyalins, occupe la totalité de la cavité abdominale, se coule en appliquant une simple pression.

Présence d'un pourcentage élevé d'ovocytes hydratés et / ou de follicules

post-ovulatoire (jour 0), avec des post-ovulatoires âgé de moins de 72 h (Jour>

2), mais avec des signes de ponte comme le nombre élevé de vaisseaux sanguins,

de l'enflure des parois de l'ovaire, l'atrésie, la désorganisation de la structure

de l'ovaire. A ce stade les femelles ne produisent plus d’ovocytes.

Regression et repos

V

VI Regression Gonade rétrécie, apparence rouge.

VII Repos Gonades en tube, orange pâle, opacité.

Un sous-échantillon composé de 234 ovaires et 111 testicules sont conservé dans le formol-aldéhyde tamponné de 10 % pour l’étude histologique.

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1.2.2.1. Inclusion à la paraffine

La première étape dans l’étude histologique est la préparation des sous-échantillons à couper, pour cela deux sections du milieu de l’ovaire ou du testicule (droite et gauche) sont découpés (Fig. 17A) et mis en cassette et remis dans une bouteille de formol à 10% pour la fixation (Fig. 17B).

Figure 17. Préparation des échantillons de gonade pour la fixation dans le formol-aldhéhyde.

A : Coupe des gonades et conservation des échantillons dans une casette; B : Conservation des cassettes dans une bouteille remplis de formol-aldéhyde tamponné de 10%; GG : Gonade

gauche; GD : Gonade droite ; Ca : Cassette.

Les cassettes préparées subissent une déshydratation dans des solutions d'alcool de degrés croissants dans un système automatique (Fig. 18). Les différentes étapes de déshydratation sont résumées dans le tableau 9, la durée de cette étape est 11 heures et demi.

Figure 18. Système automatique pour déshydratation des gonades dans l’alcool.

41 Tableau 9. Programme détaillé du système automatique de déshydratation.

étape Solution Programme

1 Etanol 70 % 30’

2 Etanol 96 % 1 h

3 Etanol 96 % 1 h

4 Etanol 100 % 1 h

5 Etanol 100 % 1 h

6 Etanol – Benezene 50 % 1 h 30’

7 Benzene 1 h

8 Benzene 1 h

9 Benzene-Paraffine 1 h 30’

10 Parafine 2

11 Parafine

TOTAL 11 h 30’

Après la déshydratation, les sous-échantillons sont prélevés et inclus dans des blocs de la paraffine (Fig. 19A). Après le séchage des blocs sous l’effet d’une baisse de température (Fig. 19B), les blocs sont nettoyés et l'excès de paraffine est éliminé (Fig. 19C), puis mis dans un congélateur à -22°C pendant une journée au minimum pour être découper par microtome.

Figure 19. Préparation des Blocs de paraffine. A : Inclusion d’un sou-échantillon de gonade dans la paraffine ; B : Refroidissement des blocs à l’aide d’une plaque froide ; C : Blocs de

paraffine nettoyés ; g : sous-échantillon de gonade ; PF : plaque froide ; Bp : Bloc de paraffine.

1.2.2.2. Coupe, coloration et observation

Des Coupes des blocs à 5 µm ont été réalisées sur un microtome, étalage sur des lames et fixation des coupes sur les lames dans un four de température 48°C (Fig. 20A, B). Ensuite nous avons fait une coloration différentielle par l’Hématoxyline-éosine en utilisant un système automatique de coloration (Fig. 20C) en suivant un programme bien spécifiques résumé dans le tableau 10.

42 Après la coloration, les lames sont couvertes de petites lamelles à l’aide de la résine.

Après le séchage les lames sont observées au microscope photonique muni d’un appareil photo qui est connecté à son tour à un ordinateur pour la visualisation des photos de différents stades de maturité sexuelle en utilisant le « ProPlus » comme logiciel (Fig. 20D, E).

Figure 20. Préparation des lames pour l’observation microscopique de différents stades de maturité sexuelle. A: Coupe des lames par un microtome; B: Etalage sur lame ; C : Coloration

à l’Hématoxyline-éosine ; D: Observation à l’aide d’un microscope photonique muni d’un appareil photo ; E : Visualisation des observations sur ordinateur.

Tableau 10. Protocole de coloration des lames à l’aide d’un système automatique de coloration.

Etapes Solution Temps (min:s)

1 Xylene 10:00

2 Ethanol 100 % 4:00

3 Ethanol 80 % 3:00

4 Eau 2:00

5 Haematoxyline (Hemato Harris) 4:00

6 Eau 2:00

7 Alcoholic acid 0:10

8 Eau 3:00

9 Lithium carbon 0:10

10 Eau 1:00

11 Ethanol 70 % 1:00

12 Eosin floxine b 2:00

13 Ethanol 96 % 2:00

14 Ethanol 100 % 2:00

15 Xylène 5:00

16 Xylène 3:00

Fin Xylène

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