Tests phénotypiques basés sur la croissance :

4.3.3. SUPERCARBA medium :

Ce milieu est recommandé pour la détection de tous types d’EPC.

5. Méthodes de détection des carbapénèmases

5.1. Tests phénotypiques basés sur la croissance :

Les tests phénotypiques basés sur la croissance évaluent la présence de carbapénèmases en détectant la croissance d'un organisme en présence d'un antibiotique et fournissent des résultats le lendemain. Des exemples de tels tests sont le Test Hodge modifié (MHT) et le CIM ou mCIM [100].

5.1.1. Concentration minimale inhibitrice [101]

Dépistage des producteurs de carbapénèmases basée sur les tests de sensibilité aux antibiotiques. La première cause de suspicion de production de carbapénémase dans un isolat clinique est une augmentation de la concentration minimale inhibitrice (CMI) du carbapénème ou une diminution du diamètre de la zone d'inhibition. Ce résultat rend un isolat bactérien éligible pour une analyse plus approfondie de la production de carbapénémase en utilisant des méthodes plus spécifiques. Les plages de sensibilité au carbapénème pour les entérobactéries, les pseudomonas et les acinetobactéries sont présentées dans le tableau.

Cependant, la détection des producteurs de carbapénémase basée uniquement sur les valeurs MIC peut manquer de sensibilité. De nombreuses entérobactéries productrices de carbapénémase présentent une large gamme de CMI avec parfois des valeurs dans la plage de sensibilité. Les CMI du carbapénème ne devraient augmenter substantiellement qu'en présence d'un mécanisme de résistance supplémentaire, comme les lésions de perméabilité dues à la mutation des protéines de la membrane externe, ou la production simultanée de céphalosporinases AmpC ou de BLSE. Les CMI du carbapénème ne devraient augmenter substantiellement qu'en présence d'un mécanisme de résistance supplémentaire, comme les lésions de perméabilité dues à la mutation des protéines de la membrane externe, ou la production simultanée de céphalosporinases AmpC ou de BLSE (Livermore et Woodford, 2006).

Tableau X: Points de rupture de la sensibilité au carbapénème pour les entérobactéries, les pseudomonas et les acinetobactères conformément aux directives européennes (EUCAST, 2014)

et américaines (CLSI, 2014) [73].

5.1.2. CIM modifiée (mCIM) [102-107] :

Le mCIM, la plus récente des deux méthodes basées sur la croissance discutées ici, nécessite l'inoculation du bouillon de l'isolat de test résistant au carbapénème en présence d'un disque de méropénème pendant 4 heures dans du bouillon de soja tryptique, suivi par le placement du disque sur Mueller-Hinton gélose (MHA) striée d'une souche indicatrice d'E.

coli sensible au carbapénème, avec incubation pendant une nuit. Le test part du principe que

les producteurs de carbapénémase hydrolyseront rapidement le méropénème dans le disque pendant la période d'incubation de 4 h de sorte que lorsque le disque est retiré et plaqué avec la souche indicatrice sensible au carbapénème, le disque a réduit ou aucune activité et produira un diamètre de la zone entre 6 et 15 mm après une nuit d'incubation. La CRE non CP n'hydrolysera pas efficacement le disque de méropénème pendant la période d'incubation de 4 h et restera active contre la souche indicatrice, produisant des diamètres de zone ≥19 mm

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boucle de 1 µl pour les entérobactéries. Il n'est pas recommandé pour la détection de CP dans

Acinetobacter baumannii en raison de mauvaises caractéristiques de performance. Une

nouvelle variante du test utilisant le tampon Tris-HCl pour l'extraction (CIMTris) détecte la production de carbapénémase chez Acinetobacter et Pseudomonas spp. Avec une sensibilité de 98% et une spécificité de 93%. Pour différencier davantage la MBL des sérines carbapénèmases, la mCIM a été davantage adaptée en ajoutant de l'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA), un chélateur de cations et un inhibiteur des MBL. L'EDTA mCIM (eCIM) est effectué simultanément avec le mCIM, et une différence de diamètre de zone ≥ 5 mm pour la souche indicatrice E. coli entre l'eCIM et le mCIM indique la production de MBL, tandis qu'une différence ≤4 mm indique la production d'une sérine carbapénémase qui n'est pas inhibée par l'ajout d'EDTA. La différenciation de MBL des sérines carbapénèmases est cliniquement utile, car les nouvelles combinaisons de β-lactamines ont une activité contre les sérines carbapénèmases mais pas contre les producteurs de MBL.

Le mCIM est une version modifiée du CIM original initialement décrit en 2015 par van der Zwaluw et al et est la modification la plus connue du CIM. Le mCIM utilise une boucle de 1 µl de la CRE au lieu d'une boucle de 10 µl pour la configuration et remplace le bouillon de soja tryptique à la place de l'eau pour une meilleure détection des producteurs de MBL qui ont besoin de cations divalents pour l'activité, et la durée de l'incubation a été prolongée à 4 heures à partir de 2 heures pour les enzymes à activité hydrolytique réduite (telles que les enzymes de type OXA) au cours de l'étape d'inactivation du disque méropénème par rapport à la CIM. Des modifications supplémentaires du CIM ont été récemment publiées, notamment un test CIMplus qui permet la détection de la carbapénémase en 8 heures et la méthode d'inactivation rapide du carbapénème (rCIM), qui réduit le temps de détection de la carbapénémase à moins de 3 heures.

Le test CIMplus implique l'incubation simultanée du disque de méropénème avec une boucle de 10 µl de la souche testée et des stries d'une plaque MHA avec une souche indicatrice d'E. Coli sensible, ce qui permet une croissance précoce de la souche indicatrice d'E. Coli pour permettre une plus grande interprétation rapide des résultats CIM lorsque les disques sont placés sur la plaque après 2 heures d'incubation avec la souche testée.

Ils décrivent également la configuration simultanée du test CIMplus avec EDTA (un inhibiteur de classe B) et un autre avec de l'acide phényl boronique (PBA; un inhibiteur de classe A) pour différencier davantage les enzymes de classe A, B et D (par un processus d'élimination). La méthode rCIM consiste à utiliser deux boucles de 10 µl de bactéries en suspension dans de l'eau stérile avec deux disques de 10 µg de méropénème pendant 30 min à 37 ° C, après quoi la suspension est centrifugée et le surnageant est ajouté à une culture en bouillon de l'E. Coli souche indicatrice et suivi de la croissance à l'aide d'un néphélomètre toutes les 30 min pendant 2 heures.

Figure 14: Méthode d'inactivation du carbapénème modifié (mCIM) et EDTA-mCIM (eCIM) [100].

5.1.3. Test de Hodge modifié [73,108-111] :

Le test Cloverleaf (ou le soi-disant test Hodge modifié [MHT]) est une version modifiée du test Hodge décrit par Hodge et al. Pour la détection de Neisseria gonorrhoeae productrice de pénicillinase, et a été traditionnellement utilisé pour la détection de carbapénémase conformément aux directives du CLSI. Il est également suggéré de l'utiliser comme test de confirmation de la production de carbapénèmases lorsque les tests de dépistage initiaux sont indicatifs. (CMI du carbapénème 1 mg / l). Cela ajoute un temps important (24 à 48 heures.

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d'un long délai d'exécution. Mais, pour résoudre ces problèmes, après avoir ajouté du zinc dans le milieu de culture, la méthode MHT serait très sensible pour détecter les carbapénèmases de classe A, B et D. Bien que cette méthode soit relativement facile à mettre en œuvre et réalisable dans les laboratoires cliniques, l'interprétation des résultats nécessite une certaine expérience.

Le test de hodge modifié est effectué sur gélose Muller-Hinton et est basé sur l'activation d'un carbapénème par une souche d'essai produisant de la carbapénèmase. Un organisme indicateur, généralement Escherichia coli à une turbidité de 0,5 Mc Farland standard, est utilisé pour inoculer la surface de la plaque, et un disque carbapnème est placé au centre. La souche d'essai est fortement striée du disque à la périphérie de la plaque. Après une nuit d'incubation, l'identification sous la forme d'un trèfle de la croissance de la souche d'essai par rapport à la souche indicatrice sensible est interprété comme un résultat positif pour la production de carbapénémase par la souche testée, l'un des avantages du test Hodge modifié est qu'il suppose une excellente sensibilité pour la détection des carbapénèmases Ambler de classe A et de classe D, permettant ainsi la détection d'enzymes à faible activité carbapénémase telles que OXA-23, GES-5 et GES-6 (Hornstein et al., 1997; Vourli et al., 2004). Lors de l'évaluation de différentes méthodes, le test de Hodge modifié utilisé en combinaison avec les tests de sensibilité au carbapénème a été sélectionné pour confirmer les producteurs de KPC parmi isolats d'Enterobacteriaceae (Anderson et al, 2007).