Identification du type de carbapénémase :

3.1. Détection phénotypique de carbapénèmases spécifiques

3.1.1. Klebsiella pneumoniae carbapenemase [76-78]

La détection phénotypique de la production de KPC est basée sur les effets inhibiteurs de l'acide boronique et de ses dérivés, l'acide phénylboronique (PBA) et l'acide 3-aminophénylboronique (APBA). Les dérivés de boronate qui ressemblent structurellement aux β-lactames sont utilisés depuis longtemps pour sonder la fonction des βlactamases, en particulier les enzymes de classe C. En 2008, Pasteran et al. Ont observé que les boronates inhibent préférentiellement les β-lactamases de type KPC. Des études proposant l'utilisation de PBA associé à un carbapénème pour l'identification des producteurs de KPC.

À partir de plusieurs β-lactames indicateurs testés, l'imipénème ou le méropénème ont montré de meilleures valeurs de sensibilité et de spécificité pour l'identification des isolats produisant du KPC ou tout autre membre des carbapénèmases de classe A. En outre, différentes valeurs de coupure des différences de diamètre de zone entre les disques

carbapénème et les disques carbapénème supplémentés en PBA ont été utilisées. Pasteran et al ont proposé une augmentation ≥ 4 mm des diamètres de zone des disques d'imipénème combinés avec du PBA par rapport à ceux de l'imipénème seul. Dans l'étude réalisée par Doi et al, Une potentialisation ≥ 5 mm a été observée pour tous les isolats producteurs de KPC, lorsque l'APB a été ajouté aux disques de méropénème. Bien que l'utilisation d'une valeur de coupure ≥ 7 mm pour les disques de méropénème, avec et sans 400 μg de PBA, s'est avérée excellente pour identifier les KPC produisant K. pneumoniae et les différencier des plasmidiques AmpC produisant K. pneumoniae et E. coli.

En général, les tests à base de boronate montrent une sensibilité élevée dans la détection des producteurs de KPC. Cependant, des problèmes de spécificité peuvent survenir avec des isolats présentant une sensibilité réduite aux carbapénèmes en raison de l'expression à haut niveau de βlactamases de type AmpC (céphalosporinases) et d'une carence en porine.

3.1.2. Métallo-β-lactamases [71]

La détection phénotypique des producteurs de MβL est basée sur l'inhibition spécifique des MβL par les agents chélateurs. Plusieurs tests reposant sur la synergie entre les inhibiteurs de MβL, le plus souvent l'EDTA, et une oxyimino-céphalosporine ou un carbapénème, ont été développés. De plus, divers tests utilisant d'autres agents chélateurs, tels que l'acide dipicolinique, la 1,10-phénanthroline et les composés thiol (acide 2-mercaptopropionique et acide mercaptoacétique sodique), ou l'utilisation d'une combinaison de chélateurs (par exemple, EDTA plus acide 2-mercapto propionique), ont également été proposés. Ces composés inactivent les MβL contre les β-lactames, en les privant de cations divalents Zn. Le test de synergie à double disque (DDST) et le test de disque combiné (CDT) sont les formats les plus couramment utilisés pour les tests de détection MβL. Le DDST utilise un disque de βlactame placé fermé à un disque avec une quantité donnée d'un inhibiteur de MβL (le plus souvent EDTA). La formation d'un modèle de synergie indique la production de MβL.

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sensibilité élevée même avec des isolats avec de faibles niveaux de résistance au carbapénème. Cependant, dans le cas du DDST, l'interprétation de ce test est subjective et ne peut pas être quantifiée.

Sur le même principe, la barrette Etest MβL (AB bioMérieux, Paris, France) est l'une des méthodes préconisées pour la détection des isolats producteurs de MβL. Cette dernière méthode, qui utilise l'imipénème et l'imipénème plus EDTA, est efficace pour détecter les producteurs de MβL présentant des niveaux élevés de résistance au carbapénème, mais peut ne pas détecter les isolats producteurs de MβL avec une faible résistance à l'imipénème. Récemment, de nouvelles bandes d'Etest, contenant du méropénème et du méropénème plus EDTA, ont été reconnues pour leur grande sensibilité et spécificité pour la caractérisation initiale des entérobactéries productrices de MβL. La sensibilité des méthodes de détection de MβL était significativement augmentée si les milieux de croissance étaient supplémentés en zinc

En général, les méthodes de détection de MβL basées sur des combinaisons β-lactame-chélateur fonctionnent bien pour K. pneumoniae et E. coli, alors qu'elles n'ont pas été systématiquement testées pour d'autres espèces entérobactériennes. En outre, il convient de souligner que la spécificité des méthodes de détection de MβL pourrait être altérée par les effets des agents chélateurs, agissant de manière non spécifique et affectant d'autres processus. Par conséquent, les résultats doivent être interprétés avec prudence et confirmés par une méthodologie de référence.

3.2. Caractérisation moléculaire des gènes de carbapénèmases [79-92]

Les techniques moléculaires restent le gold standard pour l'identification précise des gènes de carbapénémase. La plupart de ces techniques sont basées sur la technologie PCR et peuvent être suivies d'un séquençage de la région codante entière si l'identification du gène de la β-lactamase est requise. De plus, les techniques d'hybridation ont été couramment utilisées pour l'identification des gènes de carbapénémase dans les laboratoires de recherche et les centres de référence. La combinaison de techniques d'hybridation et de Southern blot est utilisée pour déterminer si le gène de la carbapénémase réside sur un plasmide ou est chromosomique.

De nos jours, de nombreux laboratoires cliniques effectuent régulièrement des méthodes basées sur la PCR «en interne» afin de négocier avec les problèmes des méthodes de détection phénotypique et de réduire le temps de détection. Une technique de PCR effectuée directement sur les colonies peut donner des résultats en 4 à 6 heures, avec une excellente sensibilité et spécificité. Les méthodes basées sur la PCR permettent la détection de carbapénèmases de type OXA contrairement à la technique basée sur les inhibiteurs. Les méthodes basées sur la PCR sont des tests de PCR simplex ou multiplex. Des analyses en temps réel, qui raccourcissent encore le temps de détection, ont également été utilisées. Récemment, la technologie des puces à ADN a été ajoutée à la liste avec les techniques moléculaires visant à la détection rapide et fiable de plusieurs déterminants de résistance.

Les principaux inconvénients des techniques moléculaires sont leur coût et le besoin de microbiologistes qualifiés. Un problème supplémentaire avec les méthodes moléculaires est que la gamme de gènes de résistance à détecter est prédéfinie. Ainsi, ces méthodes peuvent ne pas détecter de nouveaux types de gènes de carbapénémase.

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Figure 13: Organigramme pour la détection et la caractérisation des producteurs de carbapénèmases parmi les entérobactéries[93].

Le test Carba NP est utilisé pour différencier rapidement les producteurs de carbapénèmases et de non carbapénèmases. La deuxième étape comprend des techniques moléculaires (PCR ou puces à ADN) pour une identification précise des gènes de carbapénémase. Les flèches en gras indiquent la manière préférée d'identifier les gènes de la carbapénémase. Cette deuxième étape ne peut être suivie que dans les hôpitaux universitaires ou les grands laboratoires de microbiologie [93].

V. Dépistage