Détection phénotypique basée sur des agents inhibiteurs

Cette méthode est basée sur l’inhibition de l’activité des carbapénèmases par des molécules plus ou moins spécifiques.

Tableau XI: Base d’interprétation des tests de détection phénotypique [112]. Mécanisme de

résistance aux carbapénèmes

Synergie carbapénème avec Profil de résistance

EDTA ^Acide

boronique ^Cloxacilline

Acide

clavulanique ^{Aztréonam Témocilline}

KPC - +++ _ +/- R + /- MBL +++ _ _ _ S ++ OXA-48 - _ _ _ S +++ BLSE + imperméabilité ^- _ _ +++ R _ AmpC + imperméabilité ^{- + +++ _ S _}

5.2.1. Détection des MBLs basée sur des agents chélateurs [112]

La détection phénotypique des souches productrices de MBLs est fondée sur l’inhibition spécifique des MBLs par l’EDTA. Diverses techniques utilisant d’autres agents chélateurs, tels que l’acide dipicolinique, le 1,10-phénanthroline et des dérivés thiols ont été développées. Ces composés inhibent l’activité carbapénémasique des MBLs en chélatant les ions zinc présent dans le site actif de l’enzyme.

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Une variante du TSDD consiste à utiliser des disques combinés carbapénème/EDTA. Une différence de diamètre d’inhibition (déterminée par le fabricant) entre le disque combiné et le disque de carbapénème seul indique l'existence d’une MBL. La technique d’E-test MBL (BioMérieux, Solna, Suède), avec des bandelettes chargées en concentrations croissantes d’imipénème et d’EDTA, utilise le même principe.

La grande majorité des carbapénèmases produites par P. aeruginosa appartient à la famille des métallo-b-lactamases (MBLs), c’est-à-dire la classe B de Ambler. Ces enzymes hydrolysent b-lactamines à des degrés divers, à l'exception de l’aztréonam. Le bacille pyocyanique n’est pas naturellement sensible à l’ertapénème en raison de l’activité de la pompe MexAB-OprM, la résistance à cette molécule n’est pas un indicateur de production de carbapénèmase. Sept types de MBLs ont été identifiés chez P. aeruginosa (IMP, VIM, SPM, AIM, GIM, NDM-1, FIM). Comme les autres carbapénèmases de classe B, VIM-2 est inhibée in vitro par l’EDTA, ce qui le rend facile à détecter par des tests synergiques.

La détection des carbapénèmases de type MBLs est relativement facile en routine au laboratoire. L’existance d'une image synergique entre un disque de carbapénème (imipénème ou méropénème) et un disque renfermant de l’EDTA (6 mL d’une solution à 0,5 M) est un test sensible et spécifique, simple à appliquer. L’EDTA peut tout aussi bien être ajouté directement au disque carbapénème. Une différence de diamètre 5 mm entre les zones d’inhibition autour du disque carbapénème et du disque combiné sera considérée comme significative. Il faut cependant noter que des résultats faussement positifs sont régulièrement obtenus pour des souches plus sensibles à l’EDTA que la moyenne. Ce diagnostic peut également être fait avec la bandelette E-Test MBL1 qui contient, d’une part, un gradient d’imipénème (IP) et d’autre part, un gradient d’imipénème combiné à l’EDTA (IPI).

En dehors des MBLs, certains variants des BLSEs de type GES (GES-2, -5, -6, -18, -20) ont une activité carbapénèmase. Ces variants conservent plus ou moins les caractéristiques des BLSEs de classe A avec une extension de leur spectre d’hydrolyse aux carbapénèmes. Seules les techniques de biologie moléculaire (PCR), de dégradation enzymatique couplée à la spectrométrie de masse Maldi-TOF ou se basant sur l'emploi de disques combinés associant une charge élevée en cloxacilline (CLX, 4000 mg, Rosco) et en imipénème (10 mg) permettent de démontrer ces carbapénèmases chez P. aeruginosa. Une différence de diamètre

< 5 mm entre les zones d’inhibition autour du disque d’imipénème et du disque combiné (IMP + CLX) sera considérée comme significative de la production de carbapénèmase (100 % de spécificité et de sensibilité en l’absence d’une pénicillinase associée de type OXA).

Figure 16: E-test MBL (Biomérieux) [112].

5.2.2. Détection des KPC basée sur les boronates [113-116]

Cette technique phénotypique, basée sur l’inhibition des KPC par l’acide boronique et ses dérivés, les acides phénylboronique et 3-aminoboronique. Les boronates, qui partagent une relation structurelle avec les βlactamines, ont été largement utilisés pour appréhender les fonctions des β-lactamases. C’est en 2008 que Pasteran et coll. découvrent que les boronates inhibent préférentiellement les β-lactamases de type KPC. Sur le même principe que les disques combinés utilisés pour les MBLs, les disques combinant l’acide boronique avec un carbapénème ont été rapidement développés.

Malgré la très bonne sensibilité de cette méthode, son utilisation reste limité à K.

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5.2.3. Détection combinée de mécanismes de résistance aux carbapénèmes [112]

Grâce à l’utilisation de disques combinant un carbapénème avec différents inhibiteurs de β-lactamase, il est possible de détecter et d’identifier le mécanisme à l’origine de la résistance aux carbapénèmes. Ces disques combinés permettent notamment de distinguer la production d’une carbapénémase (de type KPC ou MBL) de l'existence d’une BLSE ou d’une céphalosporinase de type AmpC de haut niveau couplées à une altération des porines. Les disques KPC/MBL® de Rosco Diagnostica ont été commercialisés à cet effet : le test comprend 4 disques renfermant du méropénème seul (10 µg), du méropénème couplé à de l’acide phénylboronique (ABPA, inhibiteur de KPC), du méropénème couplé à de l’acide dipicolinique (DPA, inhibiteur des MBLs) et du méropénème couplé à de la cloxacilline (inhibiteur de céphalosporinase de haut niveau AmpC). Une différence de 5mm de diamètre entre le disque de méropénème seul et l’un des disques surchargés indique une synergie et donc le mécanisme de résistance impliqué. Sur le même principe, une étude récente propose la réalisation d’antibiogrammes sur des géloses imprégnées d’inhibiteurs de carbapénémase et de cloxacilline avec pour contrainte majeure la fabrication de ces géloses et leur validation au laboratoire.

L’interprétation de toutes ces méthodes reste délicate et requiert une formation .Ils ne conviennent pas en cas d’épidémie car ils nécessitent 18h de culture bactérienne supplémentaires. Surtout, aucune ne permet de détecter les producteurs d'OXA-48, pour lesquels il n'y a pas d'inhibiteur phénotypique sur le marché. La société Rosco Diagnostica propose depuis avril 2013 l'utilisation d’un disque de témocilline chargé de 30 µg en combinaison avec des disques de méropénème et des inhibiteurs : les producteurs d’OXA-48 sont détectés par le manque de synergie avec les disques surchargés d'un côté, et l’absence de zone d’inhibition autour du disque de témocilline d'un autre côté. Cette stratégie présente un bénéfice de spécificité par rapport au THM (59% vs > 96%) car elle permet de mieux distinguer les souches productrices de BLSE et/ou AmpC des EPC OXA-48, mais requiert encore une évaluation plus approfondie [112].