Détection moléculaire des gènes de carbapénèmases

5.5.1. Détection de carbapénèmases par PCR [101]:

La PCR devient aujourd'hui une méthode de routine dans de nombreux laboratoires cliniques pour contourner les difficultés liées à la détection phénotypique (Miriagou et al, 2010). Une technique de PCR effectuée sur l'ADN génomique peut donner des résultats dans les 4 à 6 heures et peut être suivie d'un séquençage si nécessaire pour l'identification précise d'une variante de la carbapénémase, plutôt que simplement de son groupe (par exemple, type VIM, type KPC, type NDM) et de type OXA) (Poirel et al, 2011b). La PCR peut être simple,

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également être utilisé. Plusieurs tests PCR en temps réel détectant KPC ou NDM-1 ont été décrits‚ mais, chacun ne cible qu'un seul type de gène carbapénémase.

Le test PCR en temps réel présente de multiples avantages, notamment la sensibilité, la spécificité et la possibilité d'identifier très rapidement (<2 heures) les souches productrices de NDM-1, soit pour le dépistage rapide des écouvillons rectaux, soit pour l'identification de tout isolat résistant au carbapénème.

La PCR quantitative en temps réel (qPCR) est une PCR standard avec l'avantage de détecter la quantité d'ADN formée après chaque cycle avec des colorants fluorescents ou des sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence. Les techniques de diagnostic moléculaire, en particulier qPCR, se sont avérées être des méthodes précises et rapides pour la détection des gènes blaKPC et blaNDM-1. Cette méthode est susceptible de réduire le temps de détection des carbapénèmases, en particulier dans le cas du blaOXA-48 de 48 à 4 heures. QPCR détecte les carbapéménases directement à partir d'échantillons de selles ou d'écouvillons rectaux.

La PCR-P est une autre technique consistant en une nouvelle PCR quantitative à long fragment (LF-qPCR) pour identifier le blaNDM-1 complet dans les isolats cliniques. Il s'agit d'un essai fonctionnel de protéine synthétisée in vitro pour reconnaître si les amplicons LF-qPCR contiennent du blaNDM-1 ou ses variants efficaces ou non‚ ce processus est effectué en mesurant le taux de dégradation de l'IPM.

Récemment, pour cribler les isolats contenant les gènes des KPC, un test PCR en temps réel contrôlé en interne basé sur SYBR Green a été développé et confirmé pour les souches cliniques ou les échantillons de surveillance. La méthode à base de SYBR Green est la technique la plus simple et la moins coûteuse accessible aux Pcr en temps réel. Bien que le test PCR en temps réel ne soit pas en mesure de détecter les sous-types de gènes blaKPC dans les isolats cliniques, ce test basé sur SYBR Green peut être effectué en moins de 2 heures, ce qui diminuerait la possibilité de distribution de l'organisme à l'hôpital.

Des techniques moléculaires utilisant une amplification d'acide nucléique en temps réel ou des puces à ADN offrent la possibilité fournir des résultats le jour même, permettant une intervention rapide de surveillance des infections.

Inversement, l'identification de KPC avec des tests phénotypiques peut être laborieuse et subjective; aussi, pour obtenir un résultat parfait, un temps prolongé de plus de 72 heures est également requis. Une autre méthode pour la détection qualitative de blaKPC est le test EasyQ KPC qui est une amplification basée sur la séquence d'acide nucléique en temps réel (NASBA) essai.

Récemment, un test de PCR multiplex en temps réel a été introduit qui, en une seule réaction, est capable de détecter les types les plus courants de sérine carbapénèmases et MBL (KPC, GES, OXA-48, IMP, VIM et NDM-1) chez des isolats d’entérobactéries.

Test de PCR multiplex développé par Hong et al. Pour détecter et différencier plusieurs gènes de carbapénamase de classe A dans une seule réaction.

Check-Direct CPE (Check-Points Health B.V, Wageningen, Pays-Bas) est un nouveau test PCR multiplex en temps réel qui cible les groupes NDM, KPC, VIM et OXA-48. Il a été développé pour fonctionner sur des écouvillons rectaux ou des isolats cultivés.

5.5.2. Clonage et séquençage de nouveaux gènes [101]:

Étant donné que l'amplification génique par PCR ne peut identifier que des gènes de carbapénémase avec des séquences prédéterminées, l'identification de nouveaux gènes de carbapénémase nécessite un clonage et un séquençage génétiques initiaux. Dans les expériences de clonage, l'ADN génomique de souches bactériennes est coupé par des enzymes de restriction puis laissé s'hybrider avec un plasmide qui a été coupé via la même enzyme pour créer des «extrémités collantes». Lorsque le fragment d'ADN est joint au vecteur de clonage, la molécule d'ADN recombinant résultante hébergeant le gène de la carbapénémase peut être utilisé pour transformer des cellules bactériennes compétentes, dans lesquelles le nouveau gène peut être reproduit avec l'ADN de la cellule réceptrice et purifié avant le séquençage. Plusieurs études ont utilisé des expériences de clonage pour identifier de nouveaux gènes de carbapénémase (Mugnier et al, 2008; Moubareck et al, 2009; Won et al,

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clones à haut risque qui ont un potentiel de dissémination. Le typage moléculaire doit être effectué non seulement en cas d'épidémie, mais également sur des isolats sporadiques à comparer avec des souches épidémiques (Miriagou et al, 2010).

Dans les milieux à faibles ressources, l'analyse de la parenté clonale des souches peut être effectuée en utilisant la PCR entérobactérienne à consensus répétitif intergénique (ERIC). Dans cette technique, des amorces consensus sont utilisées dans les PCR pour amplifier les séquences ERIC puis des empreintes digitales sont produites pour différents génomes bactériens (Versalovic et al, 1991; Ferreira et al, 2011). L'électrophorèse sur gel à champ pulsé (PFGE) est un outil plus précis pour établir la clonalité.

5.5.4. Puce à ADN [73]:

Les technologies de puces à ADN, parmi les méthodes actuellement disponibles, se sont révélées importantes pour la caractérisation des gènes de résistance et l'épidémiologie moléculaire. L'hybridation par microréseau est une méthode d'identification prometteuse qui pourrait détecter un grand nombre de gènes différents simultanément en une courte période. Cette technique présente des avantages considérables par rapport aux méthodes traditionnelles, car elle permet l'identification rapide des polymorphismes mononucléotidiques, une analyse multi paramétrique et utilise également un échantillon minuscule qui réduit le temps et les coûts nécessaires pour obtenir les résultats.

Pour la détection de la résistance dans différents genres, espèces ou autres groupes de bactéries, plusieurs puces à ADN ont été proposées.

En optimisant l'amplification, les gènes carbapénèmases des classes moléculaires A, B et D peuvent être amplifiés dans une seule PCR multiplex qui prend environ 40 minutes. Cependant, l'analyse d'hybridation complète prend moins de 4 heures et peut être utilisée dans les laboratoires de microbiologie clinique pour exprimer le diagnostic de la résistance aux antibiotiques causée par la production de carbapénèmases.

La puce à ADN Check-MDR CT102 (Check-Points Health BV) est un nouveau test de diagnostic moléculaire, qui permet la détection des familles de gènes BLSE (SHV, TEM et CTX-M) et des carbapénèmases les plus répandues (IMP, KPC, VIM, NDM et OXA-48). Et a une sensibilité et une spécificité de 100% pour la plupart des isolats, ce qui suggère que ce

test permet l'identification précise des producteurs de carbapénémase et des BLSE communs des cultures bactériennes. Il fournit des résultats satisfaisants sur la plupart des extraits d'ADN d'entérobactérien, Pseudomonas spp et les bactéries non fermentaires. Néanmoins, le format actuel de la puce à ADN Check-MDR CT102 convient mieux au membre des entérobactéries, car il manque de nombreux gènes importants pour une approche intégrée de la détection des principales bêta-lactamases transférables trouvées dans les non fermenteurs, comme l'OXA-23 / -24 et OXA58 de carbapénèmases pour A. baumannii ou divers VEB, GES, PER, BEL 1 et OXA ESBL pour A.baumannii et P. aeruginosa.

Figure 25: Les différentes étapes utilisées par la plate-forme Check-Points KPC / ESBL pour reconnaître des gènes bla spécifiques [152].

74 Selles - - + - + Colonies + + + + Coût + + ++ + +++ Délai 48h 48h 24h ≤4 ≤6

VI. Traitement :

1. Traitement des infections dues aux bacilles à Gram négatif résistants