Tests d’amplification et de séquençage

A partir des amorces commandées, 16 couples d’amorces ont été formés en vue de l’amplification de la région hypervariable. Chacun de ces couples a été testé sur 3 ADN tests : UK21C, UK22C et UK28C. Par ailleurs, un témoin négatif (ADN remplacé par le même volume d’eau) a été réalisé pour chaque couple tandis qu’un témoin positif (amorces d’ADN mitochondrial) a été mis en place pour chaque ADN. Tous les puits-témoins étaient disposés sur la même plaque que les puits-tests.

i. Protocole PCR

Les amorces ont été diluées jusqu’à l’obtention d’une concentration de 10 µmol/L et les ADN- tests à une concentration de 10 ng/µl. Pour la réaction PCR, les concentrations finales de chaque élément étaient les suivantes : 0,5 µmol/L d’amorces, 200 µmol/L de mélange de dNTP, 1X de tampon GoTaq, 0,1 unité d’enzyme Taq polymérase et 50 ng/µl d’ADN, pour un volume total de 25µl. Les conditions d’amplification étaient les suivantes :

o Dénaturation : 5 min à 94°C (1 cycle)

o Elongation : 45 s à 94°C, 45 s à 58°C et 45 s à 72°C (30 cycles) o Elongation finale : 20 min à 72°C puis 15°C à l’infini

ii. Electrophorèse sur gel d’agarose

Les produits PCR ont été déposés sur gel d’agarose à 1,5% puis ont migré par électrophorèse 1h à 185V. La révélation a été réalisée grâce à une table UV et la visualisation via le logiciel GeneSnap (Syngene®).

iii. Résultats

La description des couples testés et les résultats obtenus pour chaque ADN-test figurent dans le tableau 7 ci-dessous.

Tableau 7 : Résultats des tests d'amplification. 1 signifie que l'amplification a réussi, 0 qu'elle a échoué

Numéro couple d'amorce

Couple amorce Amplification

Amorce sens Amorce antisens UK21C UK22C UK28C

1 CSD_7942_Up CSD_8633_Dn 0 0 0 2 CSD_7942_Up CSD_8657_Dn 0 0 0 3 CSD_7942_Up CSD_8695_Dn 0 0 0 4 CSD_7942_Up CSD_11795_Dn 0 0 0 5 CSD_10984_Up CSD_8633_Dn 0 1 1 6 CSD_10984_Up CSD_8657_Dn 1 1 1 7 CSD_10984_Up CSD_8695_Dn 1 1 1 8 CSD_10984_Up CSD_11795_Dn 0 1 0 9 CSD_8091_Up CSD_8633_Dn 0 1 1 10 CSD_8091_Up CSD_8657_Dn 1 1 1 11 CSD_8091_Up CSD_8695_Dn 1 1 1 12 CSD_8091_Up CSD_11795_Dn 0 1 0 13 CSD_8110_Up CSD_8633_Dn 0 1 1 14 CSD_8110_Up CSD_8657_Dn 1 1 1 15 CSD_8110_Up CSD_8695_Dn 1 1 1 16 CSD_8110_Up CSD_11795_Dn 0 1 0

L’utilisation d’un marqueur de taille sur nos électrophorèses a permis de constater que les tailles des fragments obtenus étaient proches de 700 pb, soit la longueur moyenne attendue entre nos couples d’amorces. En définitive, 6 couples d’amorces (n° 6, 7, 10, 11, 14, 15) ont permis d’amplifier la région hypervariable chez nos 3 ADN-test. Ces résultats auguraient de la possibilité de choisir entre 3 amorces sens et 2 amorces anti-sens pour notre étude principale.

b. Des séquences conformes

Afin de s’assurer que les fragments amplifiés correspondaient effectivement à la région attendue, certains produits PCR ont été séquencés puis alignés sur la séquence de référence. Par ailleurs, cette étape a permis de mettre au point le séquençage pour l’étude principale.

i. Choix des produits à séquencer

Les tests de séquençage ont été réalisés sur les produits les plus longs, choisis sur la base de la netteté et de l’intensité de la bande observée lors de la révélation. Ainsi, 8 produits PCR ont été séquencés, parmi lesquels au moins 2 produits pour chacune des 3 abeilles-tests. Chaque produit a été séquencé dans les 2 sens.

ii. Protocole du séquençage o Purification (Réaction Exo/Sap)

La première réaction de purification des produits PCR vise à éliminer les amorces non fixées ainsi que les dNTP non incorporés. Entre 3 et 5 µl de produit de PCR (selon l’intensité de la bande) ont été prélevés et ajoutés à un volume complémentaire d’H2O de sorte à atteindre un volume de 14 µl, auquel a été rajouté 1 µl d’un mélange équimolaire de deux enzymes hydrolytiques (ExoI et SAP). L’enzyme SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) retire les groupes phosphates en 5’ des dNTPs en excès afin de permettre l’action de l’Exonucléase I qui digère les séquences simple brin (amorces) en dNTPs. Les conditions de cette réaction étaient les suivantes :

- Etape 1 : 45 min à 37°C (action des enzymes) - Etape 2 : 30 min à 80°C (inactivation des enzymes) - Etape 3 : 15° à l’infini

o Réaction de Sanger

Suite à la purification, la réaction de Sanger a été réalisée. Elle consiste en l’incorporation aléatoire par une ADN polymérase de didésoxyribonucléotides interrupteurs de chaîne (ddNTPs) et marqués par un fluorochrome. Chaque ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) est marqué par un fluorochrome différent dont le spectre d’émission est spécifique.

Dans un premier temps les produits de PCR sont dénaturés de sorte à permettre la fixation d’une amorce de séquençage, complémentaire du brin matrice. A la suite de cette amorce, un nouveau brin complémentaire est créé. Dans le milieu de réaction sont présents une enzyme polymérase, des dNTPs non marqués et des ddNTPs marqués. A chaque incorporation de base, il existe, pour chaque fragment, une compétition entre dNTPs et ddNTPs. A chaque fois qu’un ddNTP est incorporé, l’élongation s’arrête. Par contre, elle continue si c’est un dNTP qui est incorporé. Dans tous les cas, l’élongation de chaque produit monobrin se termine par l’incorporation d’un ddNTP marqué spécifique.

En fin de réaction, il existe donc pour chaque position nucléotidique un fragment se terminant par un ddNTP. Lors de la révélation, une analyse spectrale va différencier les différents fluorochromes et donc définir la séquence nucléotidique du brin d’ADN initial. Une représentation schématique du principe de cette réaction figure en annexe 3 tandis que le protocole utilisé est en annexe 4.

Aux 15 µl de la réaction de purification ont été ajoutés, dans chaque puit, 1 µl d’amorce de séquençage, et 4 µl d’un mélange réactionnel composé d’eau (1,5 µl), de Big Dye terminator® (0,5 µl) et de tampon (2 µl). Le Big Dye terminator® est un mélange de ddNTPs marqués par un fluorochrome et d’une polymérase. Les conditions de cette réaction étaient les suivantes :

- Dénaturation : 5 min à 94°C (1 cycle)

- Elongation : 30 s à 94°C, 15 s à 55°C et 4 min à 60°C (25 cycles) - Etape finale : 15°C à l’infini

-

o Révélation sur séquenceur

L’électrophorèse avec détection des fluorophores a été réalisée par la plate-forme INRA GenoToul. Le détail pratique et le mode opératoire complet sont consignés en annexe 5.

iii. Résultats des tests de séquençage

Les chromatogrammes de chaque réaction de séquençage ont été corrigés manuellement en utilisant le logiciel de visualisation et d’édition Chromas® (2.6) (voir figure 36). Les séquences ont ensuite été extraites au format FASTA puis alignées avec la séquence de référence (Amel_4.5) de csd grâce à un outil d’alignement de séquences multiples : Clustal Omega® (1.2.1) (Sievers et al., 2011 ; Goujon et al., 2010) puis l’alignement a été corrigé manuellement en utilisant le logiciel Jalview® (2.9) (Waterhouse et al., 2009).

Comme on peut le voir sur la figure 37 suivante, les séquences obtenues correspondent effectivement à la région que l’on cherchait à amplifier. Par ailleurs, la taille de nos séquences est en adéquation avec celle qui sépare les 2 amorces.

Sur la figure 37, la première ligne représente la séquence de référence de csd tandis que la seconde ligne est la séquence référence de l’exon 7 où est située la région hypervariable. Chaque « pack » de séquences situé en-dessous correspond à l’une de nos abeilles-tests, respectivement UK21C (en haut), UK22C (au milieu) et UK28C (en bas). On observe que cette région est effectivement hypervariable avec la taille la plus longue chez UK28C et la plus courte pour UK22C. Il est intéressant de remarquer que cette différence de taille de la région HVR était déjà visible sur l’image du gel d’agarose. En effet, pour 2 couples d’amorces ayant permis une amplification de nos 3 abeilles tests (encadré en rouge), on observe que la bande la plus haute (donc la plus longue) est à droite (UK28C) tandis que la plus basse (la plus courte) est au centre (UK22C).

Ces résultats validaient l’ensemble de notre protocole, de l’ADN jusqu’aux séquences, c’est pourquoi l’étude principale a pu être débutée.

Figure 37 : a. Région hypervariable de nos abeilles tests. b. Observation de la différence de taille sur le gel d'agarose

UK 21C UK 28C UK 22C UK 21C UK 28C UK 22C UK21C UK22C UK28C a b

C. Etude principale