Test sérologique des sérums de porcs domestiques

2.1.2. Description de la structure et des traitements réalisés dans les bâtiments

d’élevage

Afin de comprendre la distribution d’O.porcinus à Madagascar, un questionnaire (en annexe 4) a été complété pour chaque ferme examinée. Ce questionnaire comprenait une description complète des structures de la porcherie, incluant le nombre de bâtiments et le type de bâtiment dont la nature du sol, de la litière, des murs ou des clôtures, du toit et de la charpente. La pratique d’élevage (les types d’élevage et de claustration, les effectifs, les races, la prophylaxie effectuée) ainsi que des mouvements de porcs en termes d’échange, de vente, d’achat ou de saillie naturelle étaient indiqués. Les modes de traitement (ou la désinfection) habituels des bâtiments de la porcherie ont été mentionnés. Le résultat de recherche de tiques dans toutes les parties du bâtiment examiné a été aussi indiqué dans ce questionnaire.

En vue de détailler les traitements des bâtiments par les éleveurs, une étude satellite a également été conduite en 2008 dans le village d'Arivonimamo. Ce questionnaire indiquait le type de traitement, le nom et l'origine des produits et les causes de traitement.

2.2. Les analyses des échantillons et des données

Nous avons effectués toutes les analyses sérologiques au laboratoire CISA/INIA à Madrid et au laboratoire IRNASA à Salamanque, Espagne ; et toutes les analyses virologiques au laboratoire de virologie, UMR 15, CIRAD Baillarguet à Montpellier.

2.2.1. Test sérologique des sérums de porcs domestiques

Des aliquotes des sérums de porc prélevés en 2006 dans les trois zones d'étude ont été envoyées au laboratoire IRNASA (Instituto de Recursos Naturales Y Agrobiologia) à Salamanque (Espagne) et ont été analysées en vue de la détection des anticorps anti-tiques en utilisant des antigènes des glandes salivaires spécifiques aux espèces d’O. moubata.

Le test ELISA anti-tique utilisé a été développé par Canals en 1990 (Canals et al, 1990) pour détecter l’anticorps anti-glande salivaire de la tique Ornithodoros se trouvant dans le sérum des porcs et des potamochères. Il s’agit d’un outil permettant de déterminer si des tiques se sont gorgées sur l’animal et de détecter s’il y a des tiques dans les lieux où vivent le porc ou le potamochère (Pérez Sanchez et al, 1992) et (Oleaga-Pérez et al, 1994).

Initialement développé pour O. erraticus en Espagne et utilisant des extraits bruts de glandes salivaires de tiques comme antigène (Canals et al, 1990), le test a ensuite été modifié. Sa

spécificité a été améliorée par le choix de la partie soluble d’extraits de glandes salivaires (Saliva gland Extract) SGE-2, qui est exempte d'antigènes embrouillants dérivés des tissus glandulaires (Pérez-Sanchez et al, 1992). L’antigène SGE-2 est spécifiquement adapté à la tique O. moubata (Baranda et al, 1997).

L’antigène utilisé dans cette étude était l’extrait des glandes salivaires SGE-2 de l’Ornithodoros moubata (Baranda et al, 1997). Les tiques Ornithodoros moubata ont été fournies par le laboratoire IAH de Pirbright (Londres) et l’extraction de leurs glandes salivaires a été réalisée lors de notre analyse au laboratoire de Salamanque en Espagne.

a) Extraction des glandes salivaires des tiques molles O.moubata

Après une dissection des tiques adultes sous microscope binoculaire, l’emplacement des glandes salivaires a été repéré (Figure 26). Cinquante paires de ces glandes, ayant une forme tubulaire et de couleur blanchâtre (Figure 27) ont été extraites et mises dans une solution saline tamponnée aux phosphates (PBS : Phosphate Buffered Saline) de pH=7,4 à +4°C. Elles ont été ensuite rincées trois fois avec de la solution de PBS. Suspendues dans 2 ml de PBS, elles ont été congelées à -20°C et décongelées cinq fois avant d’être centrifugées à 1000 rpm pendant 30 minutes. Le surnageant a été récupéré et filtré à l'aide d'un filtre de 0,2 µm. Le produit filtré est appelé extrait de glande salivaire ou SGE qui a été servi comme antigène. La concentration des protéines a été ensuite mesurée par la méthode de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Figure 26: Tique coupée dans la partie supérieure montrant l’emplacement des glandes salivaires

b) Procédure du test ELISA utilisé

Le test ELISA indirect a été réalisé selon la méthode de Canals en 1990. La microplaque a été en premier lieu sensibilisée, chaque cupule recevant 100 µl d’antigène SGE-2 dilué à 1/100 avec une solution de carbonate (Na2 CO3 15mM, Na HCO3 34mM, pH= 9,6).

La microplaque a été ensuite incubée à 4°C toute la nuit ou à 37°C pendant une heure puis lavée 3 fois avec une solution de lavage constituée d’une solution de PBS et de 0,05% Tween 20. La saturation des sites libres a été réalisée par addition dans chaque cupule de 200 µl de solution de PBS contenant 1% de sérum de bovin ou BSA (Bovine Serum Albumin), la microplaque a été ensuite incubée à 37°C pendant une heure. Après le lavage de la microplaque, 100 l de sérum dilué à 1/50 avec de la solution de PBS Tween 20 et 0,5% BSA, ont été déposés en duplication dans chaque cupule. Après une nouvelle incubation pendant une heure à 37°C, la microplaque a été lavée avant l’addition dans chaque cupule de 100 µl de conjugué anti-porc IgG Peroxydase (Sigma) dilué à 1/6000 avec la solution de PBS Tween 20. Elle a été ensuite incubée à 37°C pendant une heure. Après un nouveau lavage, 100µl de substrat ont été déposés dans chaque cupule. Cette solution de substrat est composée de la solution d’Ortho-Phényle-Diamine (OPD) 30 mg, 50 ml de solution d’acide citrique 25 mM et de Na2HPO4 12 H20, 24 mM à pH=5 et 20 µl de H2O2 à 30%. La réaction a été stoppée en ajoutant 100 µl d’acide sulfurique 3N dans chaque cupule. La lecture de la microplaque a été réalisée avec un spectrophotomètre à 492 nm (EAR 400 FT; SLT Lab. Instruments, Germany). Des sérums de contrôle positifs et négatifs ont été inclus dans chaque microplaque.

c) Méthode utilisée pour l’obtention des sérums de contrôle (positifs et négatifs) et calcul du seuil de positivité du test

Les sérums de contrôle ont été obtenus à partir de porcs infestés expérimentalement avec l’espèce O. moubata en laboratoire (Baranda et al, 2000). Des animaux ont été infestés trois fois, tous les 15 jours, avec 1000 nymphes de stade 1 (ou N1) ou 50 adultes d’O. moubata. Des prises de sang ont été effectuées au temps zéro (pré-infestation) pour les contrôles négatifs ; 7 jours après la première infestation et à 7 et 15 jours après la troisième infestation, pour les contrôles positifs.

trois écart-types (Nebreda et al, 2003). Ainsi, tous les sérums ayant une valeur de densité optique supérieure à cette valeur calculée sont considérés comme positifs.

Dans notre étude, le seuil de positivité du test est calculé selon l'indice sérologique (IS) pour homogénéiser les résultats entre les différentes microplaques ELISA. L’IS a été calculé pour chaque densité optique (DO) obtenue lors du test en utilisant la formule suivante :

[(CN – S) / (CN – CP)] x 100

Où CN et CP représentent respectivement la valeur de DO du contrôle négatif et celle du contrôle positif et S représente la valeur de DO de chaque sérum (Hernandez-Gonzales et al,

2008).

Ainsi, les sérums ont été considérés négatifs si la valeur de l’IS était inférieure à 10 et positifs si la valeur de l’IS était supérieure à 30, particulièrement pour les valeurs de l’IS allant jusqu'à 80. Entre ces deux valeurs de l’IS (10 et 30), les sérums ont été considérés comme douteux.