Analyse virologique par la réaction d’amplification du gène de virus de la PPA

2.2.1.1.Analyse des échantillons de sang de potamochères (sur papiers filtres 3MM et sur papiers buvards FTA)

Les échantillons de sang déposés sur les deux types de papier filtre nous ont permis de déterminer lequel des deux est le mieux adapté pour l’étude. Des expériences menées au laboratoire IAH de Pirbright en Angleterre avaient indiqué que le virus pourrait être détecté par PCR dans ces deux types de papier filtre, même avec un titre viral inférieur à 10³/ ml. Le test sur papier filtre 3MM a été mis au point au CIRAD par Michaud en 2004 (Michaud et al,

2004) et présente une sensibilité élevée car le virus a pu être détecté dans un titre viral de

10/ml.

Pour le test d’amplification génomique du virus, le protocole qui a été utilisé pour la présente étude est le celui du projet Wellcome Trust (Voir Annexe 13), utilisant la solution Master Mix d’Eppendorf et le couple d’amorces (PPAVP72 sens et PPAVP72 rev) qui a respectivement comme séquences :

5’-TCGGAGATGTTCCAGGTAGG-3’ et 5’-CGCAAAAGGATTTGGTGAAT-3’ pour amplifier la protéine VP72 composée de 346 paires de base. L’amplification a été réalisée sur 35 cycles.

Il faut noter que les bouts de papiers filtres 3MM ont été déposés directement dans les microtubes pour PCR sans passer par une phase d’extraction d’ADN, tandis que les morceaux de papier buvard FTA ont été lavés selon le protocole Whatman FTA BD08 (voir Annexe 12) et déposés dans les microtubes pour PCR, sans passer également par une phase d’extraction d’ADN.

a) Préparation de la solution pour la réaction Le volume final de la solution est de 50 l. Elle est composée de :

- 20 l de la solution Master mix d’Eppendorf à 2,5X - 21,8 l d’ H2O

- 1,6 l d’amorce VP72 sens (10 pmol/ l) - 1,6 l d’amorce VP72 rev (10 pmol/ l)

- 1 disque de 2 mm de diamètre de papier filtre 3MM ou de papier buvard FTA, qui est équivalent à 1 l d’ADN, a été déposé dans le microtube de PCR.

b) Amplification de l’ADN

Les microtubes contenant la solution réactionnelle ont été déposés dans une machine PCR thermo-cycler (Applied Bio System) selon le programme suivant :

- 5 minutes à 95°C

- 35 cycles x 95°C 30 secondes / 55°C 30 secondes / 72°C 30 secondes - 7 minutes à 72°C.

c) Séparation par électrophorèse

Dix l d’amplicon ont été déposés avec 3 l de bleu de charge dans chaque puits du gel préparé avec 1% d’agarose dans la solution de TBE. Le gel contient de la solution de bromure d’éthidium (2 à 3 gouttes). L’électrophorèse a été réalisée pendant une heure sous une tension de 120 volts.

d) Lecture des résultats

La lecture des résultats a été effectuée à l’aide d’un ordinateur sous une lumière ultra-violette. Les échantillons positifs ont présenté une bande ayant une taille de 346 paires de base, comme celle du contrôle positif. Par contre, aucune bande ne devrait être vue pour le contrôle négatif.

2.2.1.2.Analyse d’échantillons de rate de potamochères

a) Préparation de l’homogénat de l’échantillon

Un échantillon de rate de 5 g environ a été lavé 3 fois avec de la solution de PBS, puis broyé avec le broyeur à ultrasons dans 2 ml de solution EMEM (Eagles Minimum Essential Medium, complétée avec 50U/ml de pénicilline, de streptomycine et de l’Amphotéricine B (antifongique). L’ensemble a été ensuite récupéré dans un tube Eppendorf de 1,8 ml et centrifugé à 8000 rpm pendant 3 minutes. Le surnageant est récolté dans un autre tube Eppendorf et conservé à -80°C jusqu’à l’extraction d’ADN.

b) Extraction d’ADN de la rate

Le Kit « GFX genomic blood DNA purification » de l’Amersham Biosciences (Cat 27-9603-01) a été utilisé lors de l’étude pour l’extraction d’ADN. Ce kit est composé de :

- Solution de lyse RBC (solution 1) : 10 mM KHCO3 ; 155 mM NH4Cl ; 0,1 mM EDTA.

- Solution d’extraction (solution 2) : solution tamponnée contenant des éléments chaotrope et

du détergent.

- Solution de lavage : solution tamponnée de Tris-EDTA avec de l’éthanol brut (l’éthanol

n’est pas fourni dans le kit)

- Colonnes GFX : colonnes de Micro Spin pré-emballées avec une matrice de fibres de verre

- Tubes de collection : microtubes de 2 ml pour la centrifugation.

Le tube contenant le surnageant conservé à -80°C a été décongelé. 200 µl de ce liquide ont été mélangés aux 500 µl de la solution 1 du kit. Le mélange est ensuite laissé pendant 1 minute à la température ambiante, puis transféré dans un tube de colonne GFX pour être centrifugé à 8000 rpm pendant une minute. Le liquide se trouvant en bas de la colonne a été jeté et le contenu retenu dans la membrane gardé ; 500 l de la solution 2 du kit sont ajoutés à ce contenu et le mélange est de nouveau centrifugé à 8000 rpm pendant une minute. Le liquide dans le tube de collection a été de nouveau jeté tandis que le contenu retenu dans la membrane mélangé avec 500 l de solution de lavage du kit. La solution de lavage a été diluée avec de l’éthanol avant utilisation (12 ml de solution de lavage + 48 ml d’éthanol). Le contenu du tube est centrifugé à 13 200 rpm pendant 3 minutes ; la solution dans le tube de collection a été jetée alors que 50 µl de H2O à 70°C ont été ajoutés au contenu retenu dans la membrane pour l’élution. L’ensemble a été ensuite placé à la température ambiante pendant une minute. Après une centrifugation à 8000 rpm pendant une minute, le contenu de la membrane a été jeté tandis que la solution se trouvant dans le tube de collection et contenant l’ADN gardée. Elle est conservée à +4°C pour être analysée par la suite en PCR.

c) Amplification de l’ADN du virus par PCR

Le protocole utilisé est celui recommandé par le projet Wellcome Trust PPA (en Annexe 13), utilisant le Master Mix Eppendorf et le couple d’amorces :

PPAVP72 sens (5’-TCGGAGATGTTCCAGGTAGG-3’) et PPAVP72 rev (5’-CGCAAAAGGATTTGGTGAAT-3’).

Cette méthode a été adoptée pour amplifier la protéine VP72 codée par le gène du virus, qui est composé de 346 paires de base. L’amplification est réalisée sur 35 cycles.

La solution réactionnelle PCR ayant un volume final de 50 l est composée de : - 20 l de Master mix d’Eppendorf 2.5X

- 21,8 l d’ H2O

- 1,6 l d’amorce VP72 sens (10 pmol/ l) - 1,6 l d’amorce VP72rev (10 pmol/ l) - 5 l de la solution d’ADN de rate

Les microtubes contenant la solution réactionnelle ont été déposés dans une machine PCR thermo-cycler (Applied Bio System) selon le programme suivant:

- 5 minutes à 95°C

- 35 cycles x 95°C 30 secondes / 55°C 30 secondes / 72°C 30 secondes - 7 minutes à 72°C.

d) Séparation par électrophorèse

10 l d’amplicon mélangés à 3 l de bleu de charge ont été déposés dans chaque puits du gel préparé avec 1% d’agarose dans la solution de TBE. Le gel contient de la solution de bromure d’éthidium (2 à 3 gouttes). L’électrophorèse a été réalisée pendant une heure sous 120 volts.

e) Lecture des résultats

La lecture des résultats a été effectuée à l’aide d’un ordinateur sous une lumière ultra-violette. Les échantillons positifs ont présenté une bande ayant une taille de 346 paires de base comme celle du contrôle positif ; par contre aucune bande ne devrait être vue pour le contrôle négatif.

2.2.2. Analyse sérologique des sérums de potamochères et de porcs