A observação de que uma deslipidificação incompleta das membranas externas resultava na solubilização de OprI ligada a outras proteínas de membrana, provavelmente através da camada lipídica, levou-nos a explorar o desenvolvimento de protocolos para obtenção e caracterização de uma formulação imunogénica baseada em fragmentos de membrana externa (formulação OMF). Esses protocolos consistiam na solubilização de preparações de membrana externa utilizando soluções com diferentes detergentes, seguida de cromatografia de afinidade em condições nativas. De acordo com a hipótese de solubilização de OprI ligada a OMF, por oposição a uma completa extracção da lipoproteína a partir da membrana, a análise por SDS-PAGE de eluatos de cromatografia assim obtidos demonstra a presença de OprI e dos seus derivados de fusão conjuntamente com outras proteínas de membrana (resultados não apresentados). A presença dessas proteínas variou quantitativamente e qualitativamente em função do tipo de detergente usado, da proporção detergente:proteína total e da solução tampão utilizada (PBS versus Tris-HCl/NaCl).
Nesta fase, realizou-se um rastreio de seis detergentes a 2% (p/v) para avaliar comparativamente a sua capacidade de solubilização de OMF contendo OprI a partir de extractos de membrana externa. Este ensaio indicou serem os detergentes OG, DM e DDM os mais eficientes nessa solubilização (Figura 13).
Figura 13 – Os detergentes OG, DM e DDM demonstram maior eficiência na solubilização de fragmentos de membrana contendo OprI.
Rastreio para identificação dos detergentes mais eficientes na solubilização de fragmentos de membrana contendo OprI. A imagem mostra as bandas correspondentes à OprI visualizadas em SDS-PAGE de eluatos obtidos por cromatografia de afinidade de membranas externas solubilizadas com seis detergentes diferentes, n-octil-β-D-glucopiranósido (OG), n-decil-β-D- maltopiranósido (DM), n-dodecil-β-D-maltopiranósido (DDM), CHAPS, FOS-CHOLINE-12 (FOS-COL) e CYMAL-5 (CYMAL).
Considerando que o OG é um detergente não-iónico dialisável, o que permite a sua remoção no final do processo de purificação, este detergente foi tido como a melhor escolha para incluir nos protocolos de preparação da formulação OMF. No entanto, uma vez que alguns ensaios preliminares de incubação de células eucariotas com amostras purificadas de OprI obtidas no sistema haviam revelado efeito citotóxico que se admitiu ser devido à presença de quantidades residuais do detergente Triton X-100 (não dialisável), entendeu-se desejável avaliar se uma eventual citotoxicidade de quantidades residuais do detergente OG poderia constituir uma limitação ao uso deste detergente em ensaios futuros. Para o efeito, expuseram-se células de linha HEK393T a diferentes concentrações dos dois detergentes, Triton X-100 e OG, e avaliou-se a viabilidade celular ao fim de 4 h (Figura 14).
Os resultados demonstram que ambos os detergentes afectam a viabilidade celular quando em concentrações elevadas. Contudo, ao contrário do verificado para o detergente Triton X-100 em que o efeito citotóxico se verifica mesmo nas concentrações mais baixas testadas, os efeitos deletérios obtidos com OG desaparecem progressivamente com a diluição
Figura 14 – O detergente OG é mais bem tolerado por células eucariotas do que o detergente Triton X-100.
A citotoxicidade dos detergentes Triton X-100 e do detergente OG foi avaliada por incubação de células HEK393T durante 4 h com concentrações decrescentes destes detergentes seguida da determinação da viabilidade celular por método colorimétrico baseado na redução de MTS. A viabilidade celular é directamente proporcional a essa redução e foi avaliada por absorvância a um comprimento de onda de 492 nm. Apresentam-se médias de duas determinações com o respectivo erro padrão. DMEM, meio de cultura utilizado como controlo negativo.
2.3. Resultados
do detergente até se obterem valores próximos do controlo a partir de concentrações de 0,0125% (p/v). Tendo em conta o facto de se tratar de um detergente dialisável, possibilitando a sua remoção ou diluição das amostras finais, este resultado reforça a opção pelo detergente OG para uso nos protocolos de obtenção de OMF.
Figura 15 - O novo sistema permite a produção de três formulações imunogénicas.
(a) Análise por SDS-PAGE de OprI, fragmentos de membrana externa (OMF) e vesículas de membrana externa (OMV). (b) Para testar a capacidade de obter um antigénio heterólogo em fusão com OprI, clonou-se a sequência codificadora da proteína A104R do vírus da peste suína africana no vector pOLPT7. Uma vez expressa, a proteína de fusão foi purificada por cromatografia de afinidade sob condições desnaturantes e o produto de eluição foi analisado por SDS-PAGE. (c) Análise por SDS-PAGE e “western blot” de preparações de OMF e OMV obtidas a partir de células expressando a proteína de fusão OprI-A104R; QB2 foi usado como anticorpo primário na análise por “western blot”. O marcador de massa molecular (M) está assinalado nos três géis.
Com base nos resultados obtidos nesta fase do trabalho e na demonstração da vesiculação de membrana externa por Escherichia coli (2.3.4), consideraram-se três formulações imunogénicas derivadas da membrana externa da bactéria hospedeira que contêm OprI ou os seus derivados de fusão: OprI, OMF, OMV (Figura 15a). O conteúdo de LPS e peptidoglicano em cada formulação foi determinado pelos métodos de LAL e SLP, respectivamente. O nível de endotoxina foi de 0,09, 3,06 e 26370,76 EU/μg de proteína para OprI, OMF e OMV, respectivamente. O peptidoglicano foi detectado apenas em quantidades vestigiais em formulações de OMV. Estes resultados revelam um potencial distinto das três formulações para activação PRR
Como modelo para demonstração da capacidade de clonagem, expressão e translocação de uma proteína de fusão lipidificada para a membrana externa para obtenção de antigénios heterólogos em fusão com OprI, clonou-se a sequência codificadora da proteína A104R de VPSA no vector pOLPT7 e o antigénio recombinante foi purificado por cromatografia de afinidade sob condições desnaturantes (Figura 15b). Na Figura 16 apresenta-se a sequência teórica da proteína de fusão e na Tabela 3 os dados relativos ao plasmídeo recombinante e seu produto de expressão. Por fim, as formulações OMF e OMV, incorporando a proteína de fusão OprI-A104R, foram preparadas de acordo com os mesmos protocolos anteriormente usados para obtenção das formulações com OprI sem fusão (Figura 15c).
1 MASMTGGQQMGRGSNNVLKFSALALAAVLATGCSSHSKETEARLTATEDAAARAQARADE 61 AYRKADEALGAAQKAQQTADEANERALRMQISENSLVISTKKKPTITKQELYSLVAADTQ 121 LNKALIERIFTSQQKIIQNALKHNQEVIIPPGIKFTVVTVKAKPARQGHNPATGEPIQIK 181 AKPEHKAVKIRALKPVHDMLNESNSSSVDKLAAALEHHHHHH-
Figura 16 – Sequência aminoacídica teórica da prolipoproteína de fusão OprI-A104R codificada no vector pOLPT7-A104R.
Apresenta-se a sequência oprI em itálico, a sequência de A104R em itálico e cheio, o péptido-sinal a sublinhado pontilhado e as “tags” T7 e 6xHis a cheio.