Remarques

1.3.4.1 Comparaison des productions de chaque forme de ligand

La figure 46 A compare les densités optiques (DO) obtenues lors des dosages d’échantillons de surnageants de Cos-7 transfectées avec les formes GST-CD40L ou CD40L dans l’ELISA FLAG. La figure 46 A 1, où l’on utilise un anticorps de détection anti-GST, montre que les quantités de GST-CD40L produites sont similaires pour 3 des 4 formes et que la forme GST-ZC-CD40L est la plus produite. La figure 46 A 2, où on utilise un anti CD40L, montre quant à elle une production identique pour les 4 formes de CD40L. On y remarque cependant un résultat inattendu. En effet, alors que dans la figure 46 A 1, l’échantillon GST-ZC-CD40L semble bien (DO 25 x plus élevée que le contrôle négatif) concentré en protéine, dans la figure 46 A 2 en revanche, la DO détectée pour ce même échantillon est proche de celle du contrôle négatif. Cela est inattendu car l’anti- CD40L est normalement capable de détecter le CD40L lorsqu’il est dans la protéine de fusion GST-ZC-CD40L (vérifié par western blot, donnée non montrée). Une explication possible est l’encombrement stérique occasionné par la GST schématisé par la double flèche grise sur la figure 46 B. La GST pourrait ainsi gêner la fixation de l’anticorps anti CD40L-rm. Le repliement naturellement important du CD40L sur lui-même pourrait en effet expliquer que la partie médiane du CD40L se retrouve contre la partie N-terminale donc contre la GST. Il est donc très difficile, de comparer les quantités produites avec les formes GST par rapport aux formes sans GST. Pour résoudre ce problème nous avons traité, dans une même analyse western blot anti CD40L-rm, des échantillons de CD40L et de GST-CD40L. Cette analyse, plus pertinente car les protéines dénaturées n’induisent plus d’encombrement stérique, a révélé des quantités de protéines très proches (données non montrées). Dès lors, la GST ne semblait donc plus nécessaire à la production en cellules de mammifères.

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Figure 46 : Effet perturbateur de la GST. La figure A met en parallèle le résultat du dosage par l’ELISA anti-FLAG d’une même protéine GST-CD40L avec anticorps de détection anti-GST (en A1) ou avec anti-CD40L (en A2). Dans les 2 dosages, de gauche à droite, le premier échantillon sert de contrôle négatif et les 4 suivants de contrôle positif de l’expérience. Le dernier est l’échantillon GST-CD40L comparé par les 2 méthodes. Les *** représentent une différence très significative (p<0,0001 dans le test de Student). La figure B schématise l’interaction potentielle de la GST avec les anticorps anti- CD40L ou le récepteur CD40. Les données présentées en A et B sont les valeurs moyennes  SD de 4 puits de culture analysés en duplicat et sont représentatives de 3 expériences indépendantes.

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1.3.4.2 Solubilité de la protéine du surnageant vs protéine du culot

Afin de mieux comprendre la répartition des CD40L retrouvés dans les culots et les surnageants des cellules Cos, nous avons analysé ces 2 fractions dans un même test. Nous avons alors réalisé une lyse cellulaire avec le tampon non dénaturant utilisé pour l’extraction en bactéries, mais non complémenté en lysozyme. Le résultat exposé à la figure 47 est une nouvelle fois interpellant. On voit en effet qu’après transfection avec plasmide codant pour GST ou GST-CD40L, bien que les 2 protéines soient présentes tant dans le surnageant que dans le culot (vérifié par extraction dénaturante avec SDS), la solubilisation dans un tampon non dénaturant du GST-CD40L contenu dans le culot est impossible. En revanche, cela ne pose aucun problème pour la GST seule. Le GST-CD40L semble donc produit sous 2 formes : l’une soluble dans le surnageant et l’autre insoluble dans le culot. L’explication pourrait être un mauvais repliement d’une partie des protéines produites. Les protéines mal repliées précipiteraient alors à l’intérieur des cellules et se retrouveraient dans les culots. Les protéines bien repliées seraient sécrétées solubles dans le surnageant.

2 Evaluation de la structure quaternaire

La figure 48 montre l’analyse par western blot de surnageants de cellules transfectées avec des plasmides pVAX codant pour CD40L. La figure 48 A compare l’analyse western blot de ZC- CD40L réalisée après SDS-PAGE, à gauche, et après électrophorèse native à droite. En SDS- PAGE, le ZC-CD40L est représenté par une seule bande de 21 kDa (flèche simple en pointillé). Comme déjà expliqué dans la partie « production en bactéries », en électrophorèse native, la préservation des liaisons faibles intermoléculaires permet la formation de multimères représentés par plusieurs (au moins 4) bandes de haut poids moléculaire (flèches simples continues). Encore une fois, la présence de ces multimères est un présage d’efficacité du ligand produit (Stone et al., 2006). La figure 48 B compare le surnageant contrôle, le ZL-CD40L et le ZC-CD40L en électrophorèse native. On remarque qu’aucune des 4 bandes (flèches simples continues) observées dans chaque échantillon de CD40L n’apparaît dans le contrôle, ce qui prouve que chaque bande est composée de CD40L. De plus, chaque bande de l’échantillon de ZL-CD40L a une masse moléculaire supérieure à la bande correspondante du ZC-CD40L.

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Figure 47: Analyses western blot anti GST des extractions natives de GST et de GST-CD40L depuis les culots de Cos-7. De gauche à droite, les images western blot montrent respectivement les échantillons de surnageants de culture, d’extractions SDS et enfin d’extractions natives des culots cellulaires des Cos transfectées avec GST (à gauche de chaque image) et GST-CD40L (à droite).

Fig 48: Analyse par Western blot anti-CD40L montrant la multimérisation des CD40L produits en cellules Cos-7. Les flèches pointillées et continues représentent respectivement les formes monomériques et multimériques des CD40L. A. Comparaison entre les analyses en conditions dénaturantes SDS-PAGE à gauche et non dénaturantes (NATIVE-PAGE) à droite du ZC-CD40L. B. Analyse en condition non dénaturante (NATIVE-PAGE) de surnageants de Cos-7 transfectées avec des plasmides pVAX vides (EpV), codant pour ZL-CD40L ou ZC-CD40L.

156 Cette augmentation graduelle et proportionnelle à la taille théorique du monomère correspondant prouve que chaque bande représente une association d’un nombre déterminé de monomères. On signalera enfin que la bande de plus petit poids moléculaire (double flèche continue) peut être un monomère ou un multimère car l’électrophorèse native ne permet pas d’estimation précise du poids. La présence des multimères n’a pas été retrouvée pour les formes dépourvues du motif de trimérisation (données non montrées).

3 Sélection des formes activant le mieux les cellules bovines

Nous avons vérifié l’activité des ligands produits en cellules de mammifères dans les 2 tests fonctionnels décrits dans le matériel et méthodes et déjà utilisés pour les productions en bactéries. Nous remarquerons ici que le 2ème test fonctionnel (activation des lymphocytes B bovins) n’est pas utilisé comme test de screening mais comme moyen supplémentaire de valider les formes présélectionnées par le test MCP-1.