Améliorations majeures apportées par le détergent Triton-X-100

Afin d’éliminer un maximum de contaminants, notamment les protéines non souhaitées qui semblaient présentes en petite quantité dans les analyses coomassie, nous avons décidé d’utiliser un détergent non dénaturant. Nous pensions que ces protéines contaminantes s’accrochaient au GST-CD40L lui-même et non à la matrice de la colonne car nous n’observions aucune bande dans les analyses coomassies des échantillons issus d’extraits de bactéries vides (voir figure 26 B). De même, nous craignions que le GST-CD40L soit adsorbé sur d’infimes fragments de membranes bactériennes de taille suffisamment faible pour rester dans le surnageant de lyse après centrifugation à 28000 g. Le détergent devait donc permettre de rompre les interactions faibles entre GST-CD40L et les protéines ou fragments de membranes contaminants. Nous avons donc essayé un détergent non ionique : le Triton X-100. Celui-ci a été ajouté au tampon d’extraction et dans tous les tampons de lavage tel que détaillé dans le matériel et méthodes. L’efficacité de cette nouvelle purification a été vérifiée par ELISA, électrophorèse et test d’activité montrés sur la figure 29. La figure 29 A montre les dosages par ELISA anti-GST du produit d’élution et du résidu protéique coincé inutilisable dans la colonne de purification pour les conditions avec et sans Triton X-100. On voit que la purification avec le Triton X-100 est significativement (p=0,0016) plus productive et que la perte de protéines par précipitation dans la colonne est très significativement plus faible (p=0,0004) comparé à la condition sans Triton X-100. Cette solubilité augmentée n’est cependant pas trop surprenante sachant que le CD40L seul s’était montré soluble uniquement dans les tampons dénaturants et détergents. La figure 29 B met en évidence une extraction globalement plus efficace et surtout une augmentation du rendement de la purification dans la condition Triton- X-100. L’éluat y est beaucoup plus concentré qui se traduit par une bande beaucoup plus épaisse à la hauteur attendue pour GST-CD40L (flèche noire). Il ne semble cependant pas y avoir

128 d’augmentation de pureté dans la mesure où les quelques traces de bandes protéiques inconnues de l’éluat semblent présentes dans les 2 conditions. Par la suite, comme expliqué dans le matériel et méthodes, le Triton X-114 a été rajouté à la fin du protocole de purification. Il est naturel de se demander pourquoi rajouter une étape de retrait du détergent après l’élution alors qu’il suffisait de ne plus en mettre dans les 2 derniers lavages. Au final les protéines se retrouvent dans un tampon sans détergent dans les 2 cas ; cependant, l’étape de décrochage (élution) des protéines semble être une étape critique qui favorise la précipitation. Il est donc préférable que cette étape ait lieu dans un tampon contenant le detergent Triton qui favorise la solubilité. Nous remarquerons que ceci n’est qu’une hypothèse pour tenter d’expliquer le rendement 5 fois supérieur (données non montrées) obtenu avec ce dernier procédé de purification.

2.3.3.2 Elimination du LPS

De nouveaux tests fonctionnels ont été réalisés avec ces derniers éluats. Le premier de ces tests a montré qu’un résidu de Triton dans l’éluat tuait les cellules endothéliales (données non montrées) et nous avons donc procédé au retrait du Triton des tampons des 2 derniers lavages de la colonne anti-GST. Cette fois, comme le montre la figure 30 A, nous avons démontré que l’activité du GST-CD40L produit n’était pas due à la pollution par le LPS, le GST-CD40L bouilli n’activant plus du tout (p= 0,0015 comparé à l’échantillon non bouilli) les BAEC. La figure 30 B montre enfin les modifications morphologiques visibles sur les BAEC activées, en haut de l’image, par le GST-CD40L purifié avec le Triton X-100. On voit en bas de l’image que la stimulation avec le GST-CD40L purifié avec Triton X-100 et bouilli n’induit plus de modifications morphologiques. Cela confirme qu’il ne contient plus de LPS. La disparition du LPS s’explique en fait par l’effet du Triton X-100.

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Figure 29: Dosage ELISA et analyse par SDS-PAGE colorée en coomassie d’échantillons purifiés avec et sans Triton X-100. A : Dosage par ELISA anti-GST d’éluats des colonnes de purification par affinité pour le GST. De gauche à droite, éluat (dilué 30x) purifié avec Triton X-100, éluat (dilué 30x) purifié sans Triton X-100, résidu de la colonne après purification avec Triton X-100 et résidu de la colonne après purification sans Triton X-100. Les ** et les *** représentent des différences significatives avec respectivement p≤ 0,0016 et p=0,0004 dans le test de Student. Les données présentées sont les valeurs moyennes  SD de triplicats du même dosage et sont représentatives de 3 expériences indépendantes. B: coloration au bleu de coomassie de SDS-PAGE d’échantillons d’extraction et de purification. De gauche à droite, extrait total sans Triton X-100, extrait total avec Triton X-100, élution de purification avec Triton X-100 et élution de purification sans Triton X-100.

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Figure 30: Test d’activation des cellules BAEC avec les GST-CD40L purifiés avec Triton X-100. La figure A montre le résultat du dosage par ELISA du MCP-1 libéré dans le surnageant (en pg/ml) des cellules stimulées. De gauche à droite, les productions induites par les stimulations réalisées avec le tampon d’élution seul, 1 ng/ml de LPS, 2 µg de GST-CD40L purifié avec Triton X-100 et 2 µg de GST- CD40L purifié avec Triton X-100 et bouilli. Les ** représentent une différence significative (p=0,0015, test de Student). Les données présentées sont les valeurs moyennes  SD de 4 puits de culture analysés en duplicat et sont représentatives de 3 expériences indépendantes. La figure B montre les modifications morphologiques visibles sur les mêmes cellules BAEC activées. En haut de l’image, la stimulation par le GST-CD40L purifié avec Triton X-100 et en bas, la stimulation par le GST-CD40L purifié avec Triton X-100 et bouilli.

Fig 31. Analyse par western blot anti-GST et coloration de coomassie des produits d’extraction et de purification de GST-CD40L et de la protéine contrôle GST. Les flèches horizontales représentent les bandes de taille attendue pour GST-CD40L. Les flèches verticales représentent les bandes de taille attendue pour le contrôle GST. La figure A montre l’analyse western blot de l’extrait total et de l’éluat purifié de GST seul à gauche et de GST-CD40L à droite. La figure B montre les mêmes échantillons traités en bleu de coomassie.

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3 Production d’une protéine contrôle

Le GST-CD40L bouilli semblait être un bon contrôle négatif, cependant, nous voulions vérifier si une protéine n’activant pas le CD40 mais produite et purifiée exactement selon le même procédé que le GST-CD40L donnerait les mêmes résultats que le contrôle bouilli. En effet, le fait de faire bouillir le GST-CD40L représentait une manipulation supplémentaire importante que ne subissait pas le GST-CD40L de la condition non bouillie et pouvait biaiser les résultats. Nous avons donc choisi de produire et de purifier la partie GST seule. La figure 31 A montre l’analyse par western blot anti-GST des produits d’extraction et de purification de la GST issue de la construction GST seule et du GST-CD40L. On vérifie que la bande obtenue pour le GST-CD40L est toujours proche de 50 kDa (flèche horizontale). On voit également que la bande obtenue pour la GST purifiée seule (flèche verticale continue) est proche de 29 kDa, ce qui est la taille théorique attendue pour cette protéine recombinante, mais est suppérieur à la taille de la GST de shistosoma japonicum du kit Invitrogen (27 kDa). Nous avons en effet allongé la séquence avec les acides aminés de la zone de jonction entre GST et CD40L présente dans la protéine de fusion. Il s’agit en fait d’une précaution prise pour que la protéine contrôle ne diffère de la protéine de fusion que par l’absence de la séquence exacte du CD40L, supprimant ainsi toute différence d’effet (entre GST-CD40L et GST contrôle) qui ne serait pas due à l’activité propre du CD40L. La figure 31 B montre un gel équivalent traité au bleu de coomassie. Les flèches correspondent aux explications déjà données pour la figure A. On remarque que la concentration en protéine GST dans l’éluat est plus importante que celle en CD40L. La GST se fixe probablement mieux que GST-CD40L sur sa colonne spécifique tout en étant plus soluble. La figure 32 montre l’effet de la stimulation des cellules BAEC avec la GST purifiée avec ou sans Triton X-114. Comme pour le GST-CD40L, l’éluat issu de la purification sans Triton aboutit à une protéine contaminée par du LPS. En effet, la GST n’est pas censée activer les cellules endothéliales, or la production de MCP-1 est proche de la production maximale. De plus, si cela était dû à un effet réel de la protéine, le traitement par ébullition de l’échantillon l’aurait abrogé. La confirmation de cette pollution nous est encore une fois donnée par le test de l’échantillon purifié avec le Triton X-114, dans lequel la GST n’active pas les BAEC. La différence entre la GST purifiée avec et sans Triton est significative (p=0,006) et cela justifie l’utilisation de la GST comme contrôle négatif. En effet, la GST réagit bien comme le GST-CD40L lors de la purification car elle fixe le LPS (ce n’était pas certain étant donné le pi de 6,1 de la GST) et en est débarrassée par le détergent.

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4 Validation de l’activité dans 2 tests fonctionnels différents