CHAPITRE 2 : LE RECEPTEUR CD40 ET SON LIGAND
4.3 Traitement avec des activateurs
4.3.4 Efficacité contre les maladies infectieuses
L’élimination complète des tumeurs grâce aux agonistes du CD40 est un exemple marquant de leur potentiel thérapeutique, mais certains succès ont également été obtenus dans le cadre de la lutte contre les infections.
4.3.4.1 Protection contre les pathogènes intracellulaires
Virus
En 1998, dans l’expérience de Beland et collaborateurs, la GVHD oriente la réponse immunitaire des souris vers le phénotype Th2 avec un taux d’IgG1 normal et un taux d’IgG2a diminué lors de l’infection par l’herpès virus simplex-1. L’injection répétée de CD40L par voie intrapéritonéale rétablit un taux d’IgG2a normal et améliore la survie des souris. Beland et collaborateurs démontrent aussi que les lymphocytes B sont indispensables à cette protection mais ne mesurent pas la réponse CTL. Quelques années plus tard, chez la souris, un vaccin ADN avec des plasmides
81 codant pour les glycoprotéines F et G du virus syncytial respiratoire et un plasmide codant pour le CD40L a permis d’augmenter significativement la clairance du virus par rapport à la vaccination avec les glycoprotéines seules (Harcourt et al., 2003). Plus récemment, un vaccin porcin composé d’un vecteur adénoviral, contenant le CD40L soluble fusionné aux glycoprotéines (GP) 3 et 5 du Porcine reproductive and respiratory syndrome virus PRRSV où le CD40L et les GP 3 et 5 sont non fusionnés, a induit une augmentation significative des réponses humorales et cellulaires et une protection partielle contre cette infection (Cao et al., 2010). Chez la souris, un vaccin ADN contre le virus Ectromelia utilisant le modified vaccinia Ankara comme vecteur, a été adjuvanté avec CD40L. Une augmentation très significative de la survie des souris lors du challenge viral a été constatée, de même qu’une forte réponse CTL (Lauterbach et al., 2013). Enfin, en 2014, Gupta et collaborateurs utilisent, à nouveau chez la souris, un plasmide codant pour une protéine de fusion composée du SP-D, du CD40L extracellulaire et de l’antigène GAG du HIV. Ils testent cette protéine en même temps que les formes anciennes décrites par Stone et collaborateurs en 2006, à la fois via des vecteurs plasmidiques et via des adénovirus. Ils constatent que les lymphocytes des souris immunisées avec la nouvelle protéine produisent plus d’IFN-γ et d’IL-2 que les souris immunisées avec l’ancienne forme. De plus, l’immunisation avec la nouvelle forme dans le vecteur adénoviral fournit une protection totale contre le challenge viral.
Bactéries
En ce qui concerne les infections bactériennes, peu d’expériences de vaccination avec adjuvant stimulant le CD40 et suivies d’un challenge infectieux ont été réalisées. Il y a tout de même Rolph et Kauffman, qui, en 2001, utilisent des anti-CD40 agonistes (clone 3/23 et clone IC10) comme adjuvant dans 2 vaccins avec des bactéries tuées par la chaleur (Listeria monocytogenes ou Salmonela typhimurium). Ils observent dans les 2 cas plus de LTCD4+ et LTCD8+ spécifiques et produisant nettement plus d’INF-γ que les contrôles n’ayant reçu que les bactéries tuées. Ils montrent également une réduction d’un facteur 1000 de la charge bactérienne après challenge et une survie de 100% contre une mortalité de 100% dans le groupe contrôle.
Protozoaires
L’élimination de certains parasites intracellulaires est également facilitée par les agonistes du CD40. Ainsi, pour Gurunathan et collaborateurs en 1998, l’administration combinée d’antigènes de L. major et de plasmides codant pour CD40L permet la résistance des souris vaccinées au challenge infectieux avec L. major. Ils confirment de plus, via la déplétion des LTCD8+, que ceux-
ci sont responsables de cette réponse cytotoxique. Ils montrent également, par l’utilisation d’anticorps anti-Il-12 que cette cytokine n’est pas indispensable à la réponse CTL, en réalité
82 induite par l’augmentation de B7 via la stimulation du CD40. Par contre, la production d’IL-12 induite par la stimulation du CD40 semble indispensable à l’induction de la production d’IFN-γ et en conséquence d’IgG2a. La stimulation du CD40 induit donc la réponse CTL directement et la réponse humorale via la production de cytokines Th1. L’ensemble permet une défense efficace contre L. major.
4.3.4.2 Le cas du bovin et de S. aureus
En 2001, des souris Severe combined immunodeficiency (SCID) au système immunitaire bovinisé, traitées avec des anti-CD40 bovins agonistes montrent une résistance accrue à l’infection par Trypanosoma congolense (Hass et al., 2001). En 2003, Manoj et collaborateurs construisent un plasmide codant pour une protéine de fusion entre la partie extracellulaire (aas 46 à 261) du CD40L bovin et la Glycoprotéine-D de l’herpèsvirus bovin-1. Leur but est d'évaluer l'effet du CD40L à la fois comme adjuvant et comme antigène vaccinal. Lors de l’expression in vitro de la protéine, ils observent la laison au récepteur, une dimérisation spontanée et l’induction de la prolifération de lymphocytes B. L’injection du plasmide aux moutons induit une augmentation de la réponse humorale contre la glycoprotéine-D. Cependant, cette même expérience n’a pas été reproductible chez le bovin, où on observe des réponses humorales et cellulaires plus faibles après immunisation avec le CD40L fusionné. Une très légère augmentation de la réponse humorale en faveur du CD40L se manifeste après le challenge viral (Manoj et al., 2004). Enfin, un vaccin ADN composé de la partie extracellulaire du CD40L bovin fusionné à la protéine majeure de surface-1 d’Anaplasma marginale et à la protéine CD205 est testé chez le veau (Njongmeta et al., 2012). L’effet du CD40L n’est cependant pas précisément évalué dans cette étude focalisée sur CD205. Nous rappellerons également l’exemple déjà cité de protection contre S.aureus conférée par l’utilisation d’anti-CD40 agonistes comme adjuvant vaccinal dans un modèle murin de mammites. Cette expérience réalisée par Wallemacq et collaborateurs en 2012 dans notre laboratoire avait alors montré une augmentation très significative de la réponse spécifique de S. aureus ainsi qu’une nette diminution de la charge bactérienne dans les glandes des souris ayant reçu l’anti-CD40.
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OBJECTIF
Comme nous l’avons vu dans la partie consacrée aux mammites à S. aureus, la vaccination semble être le traitement de choix. Il existe, de plus, plusieurs évidences d’un effet bénéfique de la réponse CTL dans la lutte contre cette bactérie. Enfin, l’activation de la voie de signalisation du CD40 est, dans de nombreuses situations, indispensable au développement de cette réponse et, même quand elle n’est pas nécessaire, elle paraît tout de même la favoriser. En prenant en compte ces 3 éléments, nous avons décidé d’utiliser une protéine recombinante CD40L bovine comme adjuvant vaccinal favorisant la réponse CTL. Nous avons alors tenté de développer le vaccin ainsi adjuvanté pour lutter contre les mammites bovines causées par S. aureus.
Deux méthodes d’administration de cet adjuvant ont été envisagées. La première, classique consiste à produire in vitro la protéine recombinante, à la purifier puis à l’injecter aux bovins. La seconde, encore largement expérimentale, consiste en l’injection de plasmides codant pour la protéine d’intérêt directement aux animaux, c’est la vaccination ADN expliquée plus haut. L’intérêt de cette dernière technique est surtout économique, la production et la conservation des plasmides étant plus facile. Elle se heurte cependant aux limites des technologies actuelles et n’est pas encore au point chez les grands animaux.
Dans ce projet, en raison de l’absence de CD40L bovin disponible sur le marché, nous produirons nous-même cet adjuvant. Nous devrons donc tout d’abord mettre au point notre propre technique de production du CD40L recombinant bovin. Nous nous attacherons ensuite à vérifier son activité dans des tests in vitro. Nous tenterons enfin d’évaluer son efficacité en combinaison avec des staphylocoques tués lors de l’immunisation de bovins.
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SECTION EXPERIMENTALE
Nous expliquerons dans la partie matériel et méthodes les techniques utilisées tout au long de ce travail. Nous détaillerons en premier lieu les étapes menant à la production de CD40L recombinants fonctionnels puis aborderons les tests in vivo utilisés pour évaluer leur potentiel adjuvant. Nous montrerons dans la partie suivante les résultats expérimentaux obtenus. Nous présenterons dans cette dernière partie les principaux succès et échecs de la production et purification puis certaines caractéristiques structurelles et fonctionnelles de nos CD40L. Les résultats obtenus in vitro seront détaillés pour les protéines produites en bactéries dans un premier chapitre et pour celles destinées à la vaccination ADN dans un second. Un 3e volet exposera l’effet de l’utilisation de l’adjuvant CD40L sur la réponse immunitaire de génisses Holstein. Nous y exposerons également les premiers résultats d’un test évaluant la protection conférée par cet adjuvant contre les mammites à S. aureus chez la vache laitière.