CHAPITRE 3 : EVALUATION DE LA REPONSE INDUITE PAR L’INJECTION
5.6 Diminution de la réponse immune aspécifique?
La mise au point de tests de dégranulation n’a pas permis de détecter d’augmentation de l’activité cytotoxique, cependant elle nous a amené à stimuler les cellules ganglionnaires en culture avec des activateurs non spécifiques tel l’anticorps anti-TCR (anti-CD3). Après abandon des tests de dégranulation, nous avons continué à utiliser l’anticorps anti-CD3 dans des tests de prolifération in vitro des cellules ganglionnaires (voir matériel et méthodes). Ces stimulations aspécifiques ont révélé un effet imprévu de la vaccination avec l’adjuvant CD40L. La figure 61 A montre la prolifération des cellules ganglionnaires totales issues des NLPC des 3 génisses du groupe C après stimulation in vitro avec des anti-CD3. On voit que la moyenne de prolifération induite par l’isotype IgG1, contrôle négatif de l’expérience est quasi nulle. On remarque que la stimulation du CD3 induit par contre une prolifération très significative des cellules ganglionnaires totales (p<0,0001) pour l’ensemble des NLPC des 3 génisses. On note de plus que la prolifération est systématiquement significativement (p<0,0001 ; ANOVA II) plus faible pour les cellules issues des ganglions GST-CD40L que pour les ganglions GST. La figure 61 B montre la prolifération des lymphocytes T CD4+, triés par FACS, issus des NLPC des 3 génisses du groupe C après stimulation in vitro avec des anti-CD3. On constate que les LTCD4+ issus des ganglions GST- CD40L prolifèrent également significativement (p<0,0001 ; ANOVA II) moins que ceux issus des ganglions GST. La figure 61 C enfin présente les mêmes conditions que la figure 61 B appliquées aux LTCD8+ triés. On remarque que la prolifération des CD8 issus des ganglions GST- CD40L est aussi significativement (p= 0,044 ; ANOVA II) plus faible que celle des LTCD8+ issus
179 des ganglions GST. Il semble donc que la vaccination avec l’adjuvant CD40L rende les cellules moins sensibles à une stimulation aspécifique ultérieure telle celle fournie par un activateur général du TCR. Dans la mesure où cela se fait parallèlement à une augmentation de la réponse spécifique, ce résultat est encourageant.
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Figure 61 : Prolifération des cellules issues des NLPC des 3 génisses du groupe C après stimulation in vitro avec des anti-CD3. La figure A montre la prolifération des cellules ganglionnaires totales. A gauche, les 2 conditions représentées par la légende « Moy IgG1» représentent les moyennes des proliférations induites par l’isotype contrôle IgG1 respectivement sur l’ensemble des cellules issues des ganglions GST et GST-CD40L. Ensuite, de gauche à droite, sont représentées les proliférations des cellules issues des ganglions GST puis GST-CD40L de la génisse C1, C2 et C3 respectivement. La figure B montre la prolifération des lymphocytes TCD4 triés par FACS. De gauche à droite, les conditions sont identiques à celles décrites pour la figure A. La figure C montre la prolifération des LTCD8+ triés par FACS et se lit comme les 2 figures précédentes. Les *** représentent une différence significative (p≤0,0001 dans l’ANOVA II). Les * représentent une différence significative (p=0,044 dans l’ANOVA II). Les données représentent les moyennes SD de 6 puits de culture.
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6 Résultats du test de protection vaccinale
Tout d’abord, comme le montre la figure 62, nous avons observé une réaction post vaccinale lors de la 3e série d’injections au jour 44 : le groupe GST-CD40L a eu une fièvre modérée, mais significative. Cela prouve que le CD40L a bien exercé son effet pro inflammatoire.
Après le challenge bactérien, nous avons évalué les signes de mammite clinique. Pour cela nous avons établi un score global sur base de l’inflammation visible de la mamelle, de la présence de caillots dans le lait ainsi que du nombre de quartiers atteints. On voit sur la figure 63 A que les symptômes des vaches vaccinées ont été très significativement réduits mais aucune différence n’a été constatée pour l’effet spécifique de CD40L. Aucune augmentation de température rectale n’a été constatée dans aucun des 3 groupes (figure 63 B).
Lors de l’évaluation des paramètres de mammite subclinique, 2 effets significatifs ont été observés. Le premier est la diminution de la charge bactérienne dans la condition GST contrôle (figure 64 A). Le second est la concentration en cellules somatiques, significativement plus faible à partir du 6e jour suivant le challenge pour les 2 groupes vaccinés (figure 64 B).
De manière générale, aucune amélioration n’a été apportée par l’adjuvant GST-CD40L par rapport à l’adjuvant contrôle GST.
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Figure 62. Relevé hebdomadaire des températures rectales avant et pendant la période d’immunisation. En gris les vaches non immunisées servant de contrôle positif pour l’infection (Ctrl+). En noir les vaches immunisées avec HKSA + adjuvant contrôle GST. En blanc les vaches immunisées avec HKSA + adjuvant actif GST-CD40L. Le * représente une différence significative entre les vaches non immunisées et la condition HKSA + adjuvant actif GST-CD40L (p= 0,0163 ; test de Student).
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Figure 63. Signes de mammite clinique observés après l’inoculation intra mammaire de S. aureus aux 3 groupes de vaches. En gris les vaches non immunisées servant de contrôle positif pour l’infection (Ctrl+). En noir les vaches immunisées avec HKSA + adjuvant contrôle GST. En blanc les vaches immunisées avec HKSA + adjuvant actif GST-CD40L. A. Score clinique évalué 2 fois par jour. B. Températures rectales. Les *** représentent une différence significative (p<0,0001 ; ANOVA 2)
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Figure 64. Paramètres de mammite subclinique mesurés après l’inoculation intra mammaire de S. aureus aux 3 groupes de vaches. En gris les vaches non immunisées servant de contrôle positif pour l’infection (Ctrl+). En noir les vaches immunisées avec HKSA + adjuvant contrôle GST. En blanc les vaches immunisées avec HKSA + adjuvant actif GST-CD40L. A. Charge bactérienne du lait en CFU/ml. B. Comptes cellulaires individuels (SCC). Les *** représentent une différence significative (p=0,0003 pour la condition GST versus Ctrl+ et p=0,0006 pour la condition GST-CD40L versus Ctrl+ ; ANOVA 2).
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DISCUSSION
1 Résumé du travail
Nous avons décidé de lutter contre les mammites bovines causées par S. aureus au moyen d’un vaccin utilisant un adjuvant particulier : le CD40L. Cette stratégie est en effet connue pour favoriser le développement d’une réponse CTL spécifique de l’antigène vaccinal administré. Elle pourrait donc permettre l’élimination des cellules épithéliales mammaires infectées par S. aureus et diminuer les dommages inhérents aux mammites persistantes causées par ce pathogène. Nous avons produit plusieurs formes moléculaires de CD40L bovins recombinants. Deux techniques ont été utilisées : la production dans un système bactérien et la production par des cellules de mammifères.
Pour la production en bactéries, nous avons dû modifier la structure de nos protéines recombinantes afin de les rendre solubles dans les tampons biologiques. A cet effet, nous avons fusionné la séquence correspondant au domaine d’homologie des TNFs du CD40L à la protéine GST. Les protéines de fusion ont alors été purifiées par chromatographie d’affinité avant d’être étudiées in vitro. Nous avons ainsi vérifié leur pureté et leur capacité à lier et à stimuler le récepteur CD40 des cellules bovines. Pour cela, nos GST-CD40L ont été incubés avec des cellules Cos-7 transfectées avec un plasmide codant pour CD40, des cellules endothéliales bovines, des PBMC ou des lymphocytes B bovins. Lors de cette étape, un problème de pollution par les endotoxines a été détecté et résolu par l’introduction du détergent Triton dans le procédé de purification. Nous avons alors relevé un effet significatif de notre CD40L à partir de 2ng/ml. La spécificité de l'effet a été vérifiée grâce à l'utilisation de contrôles négatifs tels la protéine dénaturée par l'ébullition ou encore la protéine contrôle GST produite et purifiée de la même manière. Nous avons également confronté nos GST-CD40L aux CD40L existants dans le commerce pour d’autres espèces. Ces derniers se sont montrés peu, voire pas du tout capables d’activer les cellules bovines contrairement à nos protéines de fusion. Ils présentaient de surcroît une forte pollution par les endotoxines révélatrice d’un niveau de purification médiocre. Nous avons ensuite précisé certaines caractéristiques structurelles de nos GST-CD40L tel l’arrangement en multimères ainsi que les conditions physico-chimiques nécessaires à leur stabilité. Enfin, une fois l’évaluation in vitro terminée avec succès, l’efficacité in vivo a été mesurée : des génisses ont été immunisées avec les GST-CD40L en combinaison avec des S. aureus tués par la chaleur
186 (HKSA). L’immunisation s’est révélée efficace et parfaitement répétable : les ganglions lymphatiques issus des immunisations avec GST-CD40L + HKSA présentaient une cellularité
ainsi qu’une réactivité lors des tests in vitro 2 fois supérieures à celles des ganglions contrôles issus des immunisations avec GST + HKSA. Les mêmes différences ont été observées pour les
lymphocytes TCD8+ et TCD4+. Enfin, suite aux résultats encourageants obtenus lors du test in
vivo sur les génisses, nous avons décidé de vérifier si la stimulation immunitaire observée induisait une protection contre l’infection expérimentale avec S. aureus. Malheureusement, si l’immunisation avec l’adjuvant GST-CD40L associé à HKSA a permis de réduire significativement les mammites cliniques ainsi que les comptes de cellules somatiques du lait, en revanche, il n’a apporté aucune amélioration par rapport à l’effet de l’adjuvant contrôle GST.
Pour la production en cellules de mammifères, nous avons suivi un procédé semblable, même si dans ce cas, la fusion avec la GST s’est révélée inutile et contreproductive. Les CD40L produits de cette manière ont montré une efficacité in vitro et des capacités de multimérisation supérieures aux GST-CD40L produits en bactéries. La quantité produite était par contre beaucoup plus faible et ces protéines n’ont pas pu être testées in vivo. Cette dernière technique vise en fait une voie vaccinale encore largement expérimentale qui consiste en l’injection de plasmides codant pour la protéine d’intérêt directement aux animaux, c’est la vaccination ADN expliquée plus haut.