Production et extraction de la protéine

2.1.1 Production

La production de la protéine de fusion a été réalisée comme décrit dans le matériel et méthodes et vérifiée par western blot (données non montrées) après traitement au SDS des culots bactériens totaux.

2.1.2 Extraction

2.1.2.1 Succès de l’extraction native

L’extraction au moyen du tampon de lyse non dénaturant du kit probound de chez Invitrogen a été réalisée avec succès comme le montre l’analyse en western blot de la figure 24 A. On retrouve en effet les 4 formes de ligands couplés à la GST dans les surnageants d’extraction non dénaturante comme expliqué dans le matériel et méthodes. En effet, les bandes observées correspondent aux tailles théoriques attendues soit 49,9 kDa pour GST-ZC-CD40L, 53,6 kDa pour GST-L-CD40L, 45,6 kDa pour GST-C-CD40L et 57,9 kDa pour GST-ZL-CD40L. De plus, aucune de ces bandes n’apparaît dans l’extrait issu de bactéries vides ce qui confirme que les 4 bandes décrites ci-dessus correspondent à des protéines de fusion GST-CD40L. Enfin, si les 4 protéines ont bien été solubilisées, une des 4 formes a cependant été extraite plus efficacement que les autres : il s’agit de la forme courte avec motif d’isoleucine (GST-ZC-CD40L). Cette particularité a été vérifiée lors de 2 nouvelles extractions (non montrées). Nous avons donc choisi de travailler en priorité sur cette forme, d’autant plus que la littérature donnait, en moyenne, une efficacité égale aux formes solubles courtes et longues de CD40L, et que le motif de trimérisation y était largement plébiscité (Mazzei et al., 1995; Vonderheide et al., 2001, Stone et al., 2006).

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2.1.2.2 Mise au point d’un protocole de production-extraction sur mesure

Grâce à la présence de GST, la protéine a bien été solubilisée dans un tampon de lyse non dénaturant. Cependant, la quantité de GST-CD40L soluble dans le surnageant était très faible par rapport à celle restant insoluble dans le culot d’extraction comme le montre la figure 24 B. On voit sur cette coloration au bleu de coomassie des produits d’extractions natives de GST-ZC- CD40L et de GST-C-CD40L que la protéine de fusion représentait la majorité des protéines totales du culot (très grosse bande à la taille attendue). Au contraire, dans les surnageants, la bande correspondant aux protéines de fusion n’était même pas visible parmi les autres bandes de protéines. La majorité des protéines produites restait donc inutilisable. Un nouveau protocole d’extraction a alors été mis au point en modifiant systématiquement un paramètre du protocole à chaque nouvelle extraction et en évaluant son effet sur le rendement. Nous ne reprendrons pas ici l’ensemble des paramètres testés mais seulement les 2 plus importants. Le premier paramètre appartient à la phase de production qui précède l’extraction. Comme le montre l’image western blot de gauche de la figure 25 A, la température de culture bactérienne après induction de la production par l’arabinose s’est révélée cruciale : si la production était effectuée à 37 ° C, la solubilisation de la protéine était extrêmement faible. Par contre si la production se faisait à 20°C, la quantité de protéine solubilisée augmentait fortement. Une explication plausible est qu’à 37°C, les bactéries produisent tellement de protéines recombinantes qu’elles s’agrègent immédiatement et s’accumulent dans les corps d’inclusions contenus dans leur cytoplasme. A 20°C, une partie des protéines reste soluble. Le second paramètre illustré par l’image de droite de la figure 25 A est l’effet de la présence de NaCl à 500 mM dans le tampon d’extraction. Nous avons en effet testé des concentrations en NaCl différentes de celle du tampon du kit Probound ; diminuer le taux de NaCl permet en effet parfois d’augmenter la fixation des protéines recombinantes sur les colonnes de purification utilisées à l’étape suivante.

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Figure 24: Analyse par Western blot et coloration au bleu de coomassie des produits d’extraction native de 4 formes de protéines de fusion GST-CD40L. La figure A montre l’analyse western blot anti-GST des surnageants de cette extraction. De gauche à droite, extrait de GST-ZC-CD40L, extrait de bactéries vides, extrait de GST-L-CD40L, extrait de GST-C-CD40L et extrait de GST-ZL-CD40L. Les flèches pointent chaque bande de protéines recombinantes. Figure B. Coloration en bleu de coomassie après transfert sur membrane pvdf de culots et surnageants de l’extraction. De gauche à droite, les culots d’extraction des formes GST-ZC-CD40L et GST-C-CD40L puis les surnageants d’extraction de ces mêmes formes.

Figure 25: Analyse par western blot anti-GST et par coloration au bleu de coomassie des SDS-PAGE d’extraits et d’élutions de GST-CD40L. Figure A: Images Western blot anti-GST de surnageants de différentes extractions natives. A gauche, surnageants d’extractions issus de productions à 37 et à 20 °C. A droite, Surnageant d’extraction avec tampon contenant 0 mM (à gauche) ou 500 mM (à droite) de NaCl. Figure B: Coloration au bleu de coomassie après SDS-PAGE de produits de purification du GST- ZC-CD40L. A gauche, le surnageant d’extraction native total et à droite le produit purifié par passage sur la colonne retenant la GST.

122 On remarque que lorsqu’il n’y a pas de NaCl, on n’observe qu’une bande nette à 26-27 kDa (taille attendue pour le tag GST seule) et aucune bande à 49,9 kDa (taille attendue pour le GST-ZC- CD40L). En revanche, en présence de NaCl 500mM, la bande à 49,9 kDa est importante alors que la bande à 26-27 kDa est très faible. La GST seule est probablement issue d’un clivage du GST- CD40L par des protéases. La présence de la bande GST-CD40L uniquement avec le tampon NaCl peut s’expliquer de 2 manières : en l’absence de NaCl, soit la solubilité du GST-CD40L est nulle, soit sa protéolyse est totale. Il est cependant peu probable que la protéolyse soit totale, d’autant plus que nous utilisons des inhibiteurs de celle-ci. Il est plus probable que le NaCl soit indispensable à la solubilité du GST-CD40L. Le NaCl 500 mM diminue aussi manifestement la protéolyse puisque la bande de GST clivée est quasi invisible dans cette condition. Par la suite, nous avons donc produit systématiquement à 20 °C et extrait dans un tampon contenant 500 mM de NaCl.