Comparaison des formes par le test de prolifération-agrégation des lymphocytes B

Les surnageants de Cos transfectées avec les plasmides codant pour CD40L ont ensuite été soumis au test de stimulation des lymphocytes B. Les lymphocytes B bovins ont été isolés comme décrit dans le matériel et méthodes puis cultivés pendant 72 h en présence d’IL-4 et de surnageants de Cos-7 contenant différentes formes de CD40L puis pendant 18 h en présence de thymidine tritiée. La figure 50 A montre la prolifération, évaluée grâce à l’incorporation de thymidine tritiée, de ces lymphocytes B ainsi cultivés. Deux doses différentes de LPS sont utilisées comme contrôle positif global de l’expérience. On remarque une fois de plus que toutes les formes induisent une prolifération très significativement supérieure (p<0,0001) à celle induite par le contrôle plasmide vide. Cette fois encore, le test est significativement en faveur (p< 0,001) des formes avec motif de trimérisation. La supériorité des CD40L fusionnés à l’isoleucine, toujours reproductible et ce dans 3 tests d’activation différents nous a finalement incité à ne conserver que ces formes. La figure 50 B permet quant à elle de visualiser l’agrégation provoquée par la stimulation des lymphocytes B avec CD40L. On voit sur ces photographies de microscopie optique que les 4 formes de CD40L induisent cette agrégation (présence de gros amas sphériques). Le LPS, même à très forte dose (5µg/ml), n’induit aucune agrégation. Celle-ci n’est donc due qu’à la stimulation spécifique du récepteur CD40.

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4 Choix du plasmide d’expression

Nous avons cloné les CD40L dans 2 vecteurs d’expression différents : le pcDNA3.1+ _{et le pVax.}

En réalité, nous avons commencé par le pcDNA3.1+ puis essayé d’autres plasmides (que nous ne détaillons pas dans ce travail) au moment où nous n’obtenions rien ni dans les culots ni dans les surnageants. La première apparition de la protéine dans le culot a été obtenue dans un de ces autres plasmides mais nous avons immédiatement compris que ce succès n’était pas dû au plasmide mais à l’inhibiteur du protéasome utilisé pour la première fois. Nous avons alors continué les clonages dans le pcDNA3.1+ avec lequel nous avons amélioré la production jusqu’au niveau actuel, c’est- à-dire avec suffisamment de protéines dans le surnageant pour qu’elles soient visibles en western blot. Ces protéines étaient, de plus, actives dans les 2 tests fonctionnels. Une fois ces analyses in vitro devenues satisfaisantes, nous avons cloné les 8 formes de ligand dans le plasmide pVAX censé favoriser la vaccination ADN. La figure 51 compare l’efficacité des protéines produites en pVAX par rapport à celles produite en pcDNA. Seules les formes avec motif de trimérisation et non couplées au GST sont montrées. Comme sur les figures 46, 49 et 50, le LPS est utilisé comme contrôle positif global de l’expérience et induit une production de MCP-1 significativement supérieure à celle des contrôles négatifs. Les surnageants issus des transfections par les plasmides pcDNA (en gris) ou pVAX (en noir) induisent une stimulation significativement plus forte des cellules endothéliales que les surnageants issus des transfections par les pcDNA et pVAX vides, contrôles négatifs. Par contre, lorsque l’on compare les stimulations par les surnageants de transfections issus des plasmides pcDNA et pVAX, on constate une efficacité identique. On a en effet aucune différence significative entre les pVAX et pcDNA des formes courtes et une différence tout juste significative (p=0,0468) entre les formes longues. Le plasmide pcDNA3.1+ a donc été abandonné au profit du pVAX plus prometteur pour les tests in vivo futurs. Il convient de signaler que toutes les expériences décrites dans les figures 46, 49 et 50 ont été à nouveau réalisée pour les CD40L clonés en pVAX et ont donné des résultats identiques. Le type de plasmide n’a donc pas d’impact sur la fonction de notre CD40L in vitro. Une légère différence a néanmoins été observée au niveau du rendement de la production en cellules Cos-7, avec un avantage pour le pcDNA3.1+ (donnée non montrée nettement observée en western blot). Ce phénomène était néanmoins prévisible, le pcDNA contenant le promoteur précoce et l’origine de réplication du SV40 et les cellules Cos-7 exprimant l’antigène T du SV40.

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Figure 50. Activation des lymphocytes B bovins par les CD40L recombinants produits en cellules Cos- 7. A. Prolifération après stimulation avec, de gauche à droite: milieu, 0,5 µg de LPS, 5 µg de LPS, surnageants de cellules Cos-7 transfectées avec des plasmides vides puis codant pour L-CD40L, ZL- CD40L, C-CD40L, et ZC-CD40L. Les *** représentent une différence significative (p≤0,0009) dans le test de Student. Les données représentent les valeurs moyennes  SD de 6 puits de culture et sont représentatives de 3 expériences indépendantes. B. Agrégation des lymphocytes B stimulés comme en A. Les $$ représentent une différence significative (p=0,0018 dans le test de Student). Les *** et $$$ représentent une différence très significative (p≤0,0001 dans le test de Student). Les données présentées sont les valeurs moyennes  SD de 6 puits de culture et sont représentatives de 3 expériences indépendantes.

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Figure 51. Comparaison de la production de MCP-1 induite par les 2 formes de CD40L avec motif de trimérisation en pcDNA (gris) et en pVax (noir). De gauche à droite, la stimulation induite par le milieu seul, le LPS, le pcDNA vide, le pVax vide puis les 2 formes longues, puis enfin les 2 formes courtes en pcDNA et pVax. Le $ représente une différence significative (p=0,0468 dans le test de student). Les *** représentent une différence très significative (p≤0,0001 dans le test de Student). Les données représentent les valeurs moyennes  SD de 2 puits de culture analysés chacun en duplicat et sont représentatives de 3 expériences indépendantes.

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CHAPITRE 3 : EVALUATION DE LA REPONSE INDUITE PAR