Purification et tests d’activité fonctionnelle

2.2.1 Principe de la purification utilisée

Nous avons purifié les surnageants d’extraction sur des colonnes fixant la GST en suivant les instructions du kit (Thermo scientific). Le procédé de base conseillé par la firme ressemble au protocole définitif que nous avons mis au point et qui est détaillé dans le matériel et méthodes avec quelques différences. La première différence est l’absence de Triton X-100 et X114 dans les tampons de lavage et d’élution. La seconde est un pH de 8 constant tout au long de la purification. Enfin, le nombre de lavages est réduit à 3 et les temps d’incubation sont réduits à 30 minutes pour l’étape de binding et 15 minutes pour l’élution. Le résultat des premières purifications est montré par la Figure 25 B. On remarque qu’avant purification (partie gauche de la figure), l’échantillon est composé de très nombreuses protéines qui forment de multiples bandes bleues en coloration de coomassie. Après purification par contre, on observe une simple bande dont le poids moléculaire est proche de 50 kDa ce qui correspond donc à la taille théorique de GST-ZC-CD40L. La bande est bien visible en coloration de coomassie et nous pouvons évaluer la quantité de GST- CD40L dans cette bande à quelques µg. En tenant compte du volume d’échantillon appliqué sur le gel, on peut estimer grossièrement la concentration de la protéine d’intérêt dans l éluat. Un dosage de Bradford réalisé sur l’éluat donnait 52 µg/ml et corroborait l’estimation. Comme cette concentration restait relativement faible et que, de plus, des protéines précipitées avaient été observées dans la colonne, nous avons tenté d’améliorer le rendement de l’étape « colonne ». La figure 26 A montre 2 paramètres influençant fortement le rendement de cette étape : il s’agit du pH de l’élution et de la concentration en NaCl de l’élution. On remarque que l’éluat le plus

123 concentré en GST-CD40L (102 µg/ml) est obtenu avec 500 mM de NaCl et un pH d’élution de 9.5 et que ce taux diminue à mesure que la concentration en NaCl et le pH diminuent. Au pH physiologique et à concentration en NaCl isotonique, la concentration en GST-CD40L n’est que de 45 µg/ml environ. Nous avons remarqué qu’au-dessus de pH 9,5 le rendement n’augmente pas. La figure 26 B illustre le meilleur rendement obtenu avec la combinaison des techniques d’extraction mises au point précédemment et de l’élution pH 9,5 et 500 mM NaCl. On voit en effet une large bande de GST-CD40L purifié présente sur le côté droit du SDS-PAGE colorée au bleu de coomassie.

2.2.2 Premier test fonctionnel

Ayant obtenu une quantité de protéine purifiée et soluble raisonnable, nous avons entrepris de tester son activité biologique sur des cellules bovines. En 1999, Thienel et collaborateurs avaient démontré la sécrétion de MCP-1 suite à la stimulation du CD40 des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine. Nous avons acquis une culture de cellules aortiques endothéliales bovines primaire (BAEC), confirmé par western blot l’expression du CD40 à leur surface et procédé aux tests décrits dans le matériel et méthodes. La figure 27 A montre un résultat représentatif des 3 premiers tests de dosage par ELISA du MCP-1 sécrété lors de la stimulation des BAEC. On voit que le contrôle négatif général, c’est-à-dire le tampon d’élution seul, induit la production de 1300 pg/ml de MCP-1, valeur égale à la production basale (milieu RPMI seul), ce qui permet de vérifier que le tampon de purification ne stimule pas les BAEC. Pour le contrôle positif général de l’expérience, c’est à dire 1 ng / ml de lipopolysaccharide (LPS), la production de MCP-1 est supérieure à 10000 pg/ml ce qui est très significativement supérieur (p≤0,0014) aux contrôles négatifs. Les protéines GST-CD40L induisent une forte production de MCP-1, autour de 11000 pg / ml, mais cela n’est pas dû à l’activité de la protéine. En effet, le même niveau de stimulation est constaté lorsqu’on utilise la protéine bouillie, donc dénaturée et inactive, ce qui trahit la présence d’endotoxines bactériennes dans l’éluat. On peut tirer une telle conclusion dans la mesure où, contrairement aux protéines, le LPS résiste parfaitement à l’ébullition (Magalhães et al., 2007).

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Figure 26: effet du pH et de la concentration en NaCl du tampon d’élution sur le rendement de la purification de GST-CD40L. La figure A montre les dosages des protéines solubles retrouvées dans l’élution des différentes conditions de tampons testées exprimés en % du maximum obtenu à pH 9,5 et 500 mM de NaCl. En noir les tampons avec 500 mM de NaCl et en gris les tampons avec 150 mM de NaCl. De gauche à droite, tampons de pH décroissants (de 9,5 à 5). Les données présentées sont les valeurs moyennes  SD de 2 dosages indépendants. La figure B montre de gauche à droite, une analyse par coloration au bleu de coomassie de l’extrait total de GST-ZC-CD40L, puis des éluats de colonnes d’affinité pour la GST issus d’extraits de bactéries vides et de GST-ZC-CD40L.

125 Les clichés de microscopie de la figure 27 B exposent les modifications morphologiques exprimées par les BAEC suite aux stimulations par le tampon contrôle, le LPS, le GST-CD40L et le GST-CD40L bouilli. On remarque que l’aspect pavimenteux régulier des cellules non activées laisse la place à une forme étirée, voire globulaire avec perte d’adhérence au fond du puits lorsqu’elles sont stimulées avec du LPS. La purification réalisée telle que décrite dans le paragraphe précédent était donc incomplète et le taux d’endotoxines final trop élevé pour pouvoir interpréter le test MCP-1.