Absence de la protéine dans les surnageants

Même après avoir réussi à détecter par western blot les CD40L dans les culots de cellules Cos-7, nous n’y parvenions toujours pas dans les surnageants. Nous avons alors décidé d’augmenter la sensibilité du test de détection en utilisant l’ELISA anti-GST. La figure 41 montre le premier dosage par ELISA anti-GST réalisé sur des surnageants de Cos-7 transfectées avec les plasmides codant pour GST-CD40L ou contrôles. On remarque que la densité optique (figure 41 A) ainsi que la concentration protéique (figure 41 B) obtenue pour les conditions transfectées avec les plasmides GST et GST-ZC-CD40L est significativement supérieure (p≤0,0006 ; test de t) à celle obtenue avec les contrôles plasmides vides ou plasmides codant pour ZC-CD40L. La GST et le GST-ZC-CD40L ont donc bien été produits dans le surnageant des Cos transfectées. Ce résultat confirme aussi que cet ELISA anti-GST a une plus grande sensibilité que le western blot employé jusque-là. Pour détecter les formes sans GST, nous avons utilisé un autre dosage ELISA, basé sur un coating avec un anticorps anti-FLAG (voir matériel et méthodes). En effet, nous avions préalablement couplé le peptide FLAG à l’extrémité N-Terminale de toutes les formes de CD40L, y compris les GST-CD40L comme expliqué au point précédent. Nous avons alors pu comparer les productions de formes avec et sans GST.

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Figure 40: analyse western blot anti-CD40L montrant l’effet du MG132 et du peptide signal sur la production en cellules Cos-7. La figure A montre l’analyse d’extraits de culots de cellules Cos transfectées avec le pcDNA codant pour ZC-CD40L avec et sans MG132. De gauche à droite, échantillon issu de la transfection avec le protocole standard et échantillon issu du traitement avec MG132. La figure B montre, de gauche à droite, l’analyse d’extraits de transfections réalisées sans et avec peptide signal du preprotrypsinogène (PR).

Figure 41: dosage par ELISA anti-GST de surnageants de Cos-7 transfectées. De gauche à droite, transfection réalisée avec contrôle négatif pcDNA vide, puis codant pour ZC-CD40L (second contôle négatif), GST et GST-ZC-CD40L. La figure A donne les DO obtenues lors du premier dosage réalisé. La figure B donne les concentrations en GST-CD40L évaluées, grâce au dosage simultané d’un échantillon purifié de GST-CD40L de concentration connue. Les *** représentent des DO significativement différentes des contrôles (p≤0,0006, test de t). Les données présentées sont les valeurs moyennes  SD de 3 duplicats et sont représentatives de 3 expériences.

146 La figure 42 A montre, à gauche un schéma de la technique de détection employée et à droite le résultat du dosage des formes FLAG-GST-CD40L avec un anticorps de détection anti GST. On remarque que tous les dosages d’échantillons issus des formes contenant le GST sont caractérisés par une DO très significativement supérieure (p ≤ 0,0004 ; test de t) à celle de l’échantillon FLAG- ZC-CD40L, contrôle négatif ne contenant pas le GST donc non détecté par cet ELISA. Toutes ces formes ont donc bien été produites, avec un maximum de production pour FLAG-GST-ZC- CD40L et FLAG-GST. La figure 42 B rappelle de même, à gauche, le schéma technique et montre, à droite, le résultat du dosage des formes FLAG-CD40L avec l’anticorps de détection anti- CD40L-rm. On remarque que tous les dosages d’échantillons issus des formes contenant le CD40L sont caractérisés par une DO significativement supérieure (p ≤ 0,002, test de t) à celle de l’échantillon FLAG-GST, contrôle négatif ne contenant pas le CD40. Les 8 formes ont donc bien été produites.

1.2.2.2 Production trop faible

Nous avons commencé par évaluer la quantité de GST-CD40L présente dans les surnageants de Cos-7. Pour cela, du GST-CD40L purifié produit en bactéries a été utilisé comme étalon tel que décrit dans le matériel et méthodes. Les dosages par ELISA des surnageants de cellules Cos transfectées ont montré des concentrations en protéines GST-CD40L d’environ 80 ng/ml (voir figure 41 B) Nous avons alors tenté d’augmenter la concentration de la protéine produite dans le surnageant des Cos-7.

Deux stratégies ont été utilisées : améliorer l’efficacité de la transfection et diminuer le volume de milieu de culture par quantité de cellules. La production a été suffisamment améliorée pour qu’une bande de GST-CD40L apparaisse pour la première fois à l’analyse western blot de la figure 43 A. Après quelques essais supplémentaires, la production de protéine et la sensibilité de notre analyse western blot est devenue suffisante pour observer des bandes de formes CD40L non couplées au GST. La figure 43 B montre ainsi le résultat du western blot anti-CD40L-rm réalisé sur des échantillons de surnageants de Cos transfectées avec les plasmides codant pour CD40L. On voit que les échantillons de surnageants issus des transfections par les 4 plasmides codants pour les formes de FLAG-CD40L montrent tous une bande différente. Aucune bande n’est, par contre, apparue pour l’échantillon issu du contrôle plasmide vide. La figure 43 C montre l’analyse par western blot d’un échantillon de surnageant de Cos transfectées en parallèle avec un échantillon contenant 25 ng de protéine purifiée.

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Figure 42: dosage par ELISA anti-FLAG de surnageants de Cos-7 transfectées. La figure A montre les dosages des formes GST avec l’anticorps de détection anti-GST. De gauche à droite, transfection avec pcDNA codant pour CD40L sans GST (contrôle négatif), puis pour la GST, la forme longue, la forme longue avec motif de trimérisation, la forme courte et enfin la forme courte avec motif de trimerisation. La figure B montre le dosage des formes sans GST avec l’anticorps de détection anti CD40L. La GST sert de contôle négatif et les formes sans GST sont placées dans le même ordre que les formes GST de la figure A. Le ** et les *** représentent des DO significativement différentes des contôles (p= 0,002 et p≤0,0004 respectivement dans le test de t). Les données présentées sont les valeurs moyennes  SD de 3 expériences indépendantes.

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Fig 43: Analyses western blot de surnageants de cellules Cos transfectées et de protéines purifiées. La figure A expose la première analyse par western blot anti-GST d’un échantillon de surnageant de cellules Cos transfectées avec le protocole final de transfection. De gauche à droite, la protéine purifiée servant de contrôle positif et le GST-ZC-CD40L produit en Cos. La figure B montre l’analyse par anticorps anti-CD40L de 5 surnageants de Cos-7 transfectées avec des plasmides vides sur la bande de gauche, ou codant pour les 4 formes de CD40L non couplés à la GST sur le reste de l’image. La figure C compare la bande de GST-ZC-CD40L obtenue par analyse anti-GST d’un surnageant de Cos transfectées (à droite) à la bande obtenue avec une dose connue de protéines purifiées (à gauche).

149 L’intensité similaire des 2 bandes spécifiques confirme la présence d’environ 25 ng de GST- CD40L par 100 µl de surnageant, c’est-à-dire 250 ng/ml.