Rôle de la Phosphorylation de l’IN

Pour étudier la fonction de cette phosphorylation, les résidus S24 et S255 ont été mutés par une alanine ou par un acide aspartique puis les mutations ont été introduites dans l’IN recombinante. Après avoir étudié la phosphorylation de ces mutants comme mentionnée ci-dessus, l’effet de ces

1 2 3 4

a _b

mutations a été étudié sur les activités catalytiques in vitro. Les mutations introduites au sein de l’IN recombinante peuvent induire des changements conformationnels. Le profil de digestion avec la trypsine des différents mutants a été étudié pour observer de possibles changements de conformation.

D’autre part, des virus contenant l’IN portant les mêmes mutations ont été produits et l’effet de ces mutations a été observé sur la réplication virale.

3.1. Effet des mutations sur l’IN in vitro

Activité catalytique

L’activité catalytique des différentes enzymes exprimées chez la bactérie a été testée in vitro dans notre laboratoire par Mohammed Benleulmi. Pour cela un test d’intégration concertée a été réalisé à partir d’un substrat non processé. Les produits d’intégration sont générés sous forme d’autointégration (AI) d’un ADN donneur dans un autre, et sous forme d’hétérointégration d’un ADN donneur dans un ADN receveur. Parmi ces formes, nous pouvons distinguer l’intégration partielle « Half Site Integration » (HSI) et l’intégration concertée des deux extrémités dans un seul ADN receveur, « Full Site Integration » (FSI) qui mime la réaction d’intégration dans la cellule. La comparaison entre l’activité de l’IN WT et des IN mutées permet de dire que toutes les IN sont actives in vitro, et capables de catalyser de l’intégration FSI (figure 61). De plus nous avons vérifié l’activité de « 3’-end processing » et de transfert de brin à l’aide de tests spécifiques, et nous n’avons pas observé de différence entre les mutants et l’IN WT (résultats non montrés).

Une analyse plus poussée serait nécessaire pour observer des différences fines d’activités entre l’IN WT et les IN mutées. Mais ces résultats suggèrent que les mutations introduites au sein de l’IN n’affectent pas de manière drastique les activités catalytiques de l’enzyme.

Phosphorylation de l’IN du VIH-1

FSI HSI

AI

Figure 61. Test d’intégration concertée des IN mutées sur la sérine 24 et 255. Le test est réalisé

comme décrit dans le Matériels et Méthodes. Après migration sur gel d’agarose les produits sont révélés par autoradiographie.

Caractéristiques conformationnelles des mutants

Il est connu que la phosphorylation d’une protéine peut induire un changement de conformation de cette dernière, changement qui peut entraîner une différence d’accessibilité de cette protéine aux protéases telle que la trypsine. Afin d’analyser de potentiels changement dus à la phosphorylation de l’IN, la sensibilité à la digestion par la trypsine des mutants mimant une phosphorylation S24D, S255D et S24D/S255D a été comparée à l’enzyme WT. L’analyse des produits de digestion sur gel SDS-PAGE permet de conclure que les profils de digestion des INs mutées sont comparables à celui de l’IN WT (figure 62). Dans ces conditions, la substitution par un acide aspartique des sérines en position 24 et/ou 255 de l’IN ne provoque pas d’important changement de conformation qui soit visible dans ce test.

HSI

FSI

WT S24D S255D S255D S24D

Trypsine (µg) _{0 2 5 0 2 5 0 2 5 0 2 5}

Figure 62. Digestion trypsique des IN WT et des mutants S24D, S255D et S24D/S255D. 15 µg

d’enzyme sont digérés pendant 5 min en présence de 2 µg ou de 5 µg de trypsine dans un tampon réactionnel contenant 100 mM de Tris HCl pH 7,5 et 0,001 % SDS. Les produits de digestion sont séparés sur gel SDS-PAGE 12 % puis colorés au bleu de Coomassie.

3.2. Rôle de la phosphorylation sur le cycle viral

Les mutations S24A, S24D, S255A, S255D, S24A/S255A et S24D/S255D ont été introduites dans la région du gène pol codant pour l’intégrase par mutagénèse dirigée sur le plasmide pCMVΔ8.91. Une fois la séquence du plasmide vérifiée, il est utilisé pour la production des lentivirus pseudo-typés VSV-g portant les différentes mutations sur l’intégrase. Au moins deux productions indépendantes ont été réalisées pour chaque virus.

La production des particules virales est effectuée par la Plateforme de Vectorologie de l’Université de Bordeaux (voir le Matériels et Méthodes). Le dosage de p24 est réalisé par ELISA. A partir ce dosage, le nombre de particules totales est déterminé en estimant que 1 pg de p24 équivaut à 1000 particules. Une même quantité de particules pour chaque virus sera utilisée pour normaliser les expériences d’infection.

a.

Dans un premier temps, l’infectivité des virus a été mesurée dans des cellules 293T. Pour ce faire, 50 000 cellules sont mises en culture dans des plaques 48 puits. L’infection avec une M.O.I de 1 est

Phosphorylation de l’IN du VIH-1 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Int ens it é moy enn e de f luor es c ence (A U) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 C e llu le s inf ec tée s ( % ) * ^*

réalisée après 48 heures de culture. Les cellules sont récupérées et analysées par cytométrie en flux. En effet, l’ARN viral code pour l’EGFP, une fois reverse transcrit et intégré, le pourcentage de cellules infectées est déterminé par mesure de la fluorescence de l’EGFP. Nous analysons également l’intensité moyenne de fluorescence, ce qui permet de quantifier l’expression moyenne d’EGFP par cellule infectée.

L’infectivité des virus S255A et S24A/S255A est augmentée de manière significative par rapport au WT (figure 63 (a)). En effet le nombre de cellules fluorescentes pour ces deux mutants est 2,5 fois supérieur à celui du WT. Quant aux autres mutants, aucune différence significative d’infectivité n’est observée par rapport au WT. Nous pouvons donc conclure que la mutation S255A que ce soit pour le simple ou le double mutant entraîne une augmentation de l’infectivité.

Pour L’intensité moyenne de fluorescence, aucune différence significative n’est observée entre les mutants et le WT (figure 63 (b)).

Figure 63. Infectivité des virus WT et mutants. Les cellules 293T sont infectées avec une M.O.I de

1, pendant 48 heures. Le pourcentage de cellules fluorescentes (a) et l’intensité moyenne de fluorescence (b) sont obtenus par cytométrie en flux. Ces résultats sont la moyenne d’au moins trois expériences indépendantes. Les différences significatives par rapport au WT sont déterminées par un test de Student. *p<0,05

Pour déterminer si l’augmentation d’infectivité des virus S255A et S24A/S255A pouvait être reliée à une absence de phosphorylation par GCN2, nous avons comparé l’infection des virus mutants et WT dans des cellules exprimant GCN2 (MEFs GCN2 ^+/+) à celle dans des cellules dont l’expression de GCN2 est supprimée par « Knock Out » (MEFs GCN2 ^-/-).

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 C el lul es i nf ec tée s (%) * * 0 5 10 15 20 25 30 C el lul es inf ectées (%) * *

Pour les cellules MEFs GCN2 ^+/+, nous retrouvons les mêmes résultats que dans les cellules 293T, à savoir une stimulation de l’infection pour les mutants S255A et S24A/S255A (figure 64 (a)). Les virus mutants S255D et S24D/S255D, qui miment une intégrase phosphorylée, présentent un pourcentage d’infectivité similaire au virus WT dans les conditions où GCN2 est exprimée et peut potentiellement phosphoryler l’IN WT ((figure 64 (a)). Dans les cellules MEFs GCN2 ^-/-, l’infectivité des mutants S255A et S24A/S255A est similaire à celle du WT. Alors que pour les mutants S255D et S24D/S255D, une diminution du nombre de cellules infectées est observée par rapport au WT (figure 64 (b)). Lorsque l’expression de GCN2 est réprimée (MEFs GCN2 ^-/-), l’IN WT ne peut pas être phosphorylée par GCN2, le virus WT a alors un comportement similaire aux mutants S255A et S24A/S255A qui miment une IN non phosphorylée. Il semblerait donc que la phosphorylation de l’IN, sur la sérine 255, ait un effet restrictif sur l’infection et que cet effet soit dépendant de la présence GCN2.

Figure 64. Infectivité des virus WT et mutants dans les cellules MEFs GCN2 ^+/+ et MEFs GCN2 ^-/-.

Les cellules MEFs GCN2 ^+/+ (a) etMEFs GCN2 ^-/- (b) sont infectées avec une M.O.I. de 1, pendant 48

heures. Les résultats correspondent à la moyenne du pourcentage de cellules fluorescentes d’au moins trois expériences indépendantes. Les différences significatives par rapport au WT sont déterminées par un test de Student. *p<0.05

Phosphorylation de l’IN du VIH-1

Nous observons une augmentation de l’infectivité pour les virus WT et mutants dans les cellules MEFs GCN2 ^-/- par rapport aux MEFs GCN2 ^+/+. L’absence de GCN2, comme nous l’avons déjà vu avec le virus WT, entraîne une stimulation de l’infection et ceci indépendemment de la phosphorylation de l’IN. La régulation de l’infection par GCN2 se fait donc via la phosphorylation de l’IN mais également via un autre mécanisme.

b.

La stimulation de l’infectivité observée avec les mutants S255A et S24A/S255A peut être accompagnée d’une augmentation du nombre d’évènements d’intégration. Afin de déterminer la quantité d’ADN intégré dans les cellules infectées par le WT ou les virus mutés, nous avons réalisé une PCR quantitative (voir Matériels et Méthodes). Les cellules sont alors infectées et l’ADN est extrait 14 jours après l’infection ce qui permet d’élimer l’ADN viral non intégré et l’ADN plasmidique contaminant utilisé pour la production des virus. Etant donné que l’infection dans les cellules 293T est plus efficace que dans les MEFs GCN2 ^+/+ et que nous obtenons entre les deux types cellulaires les mêmes profils d’infectivité pour les mutants, nous avons décidé de réaliser ces expériences sur le modèle de cellules 293T.

Les résultats obtenus correspondent au nombre de copie d’ADN intégré par cellule dans la population totale (figure 65). Dans la population cellulaire totale, une élévation significative du nombre de copie d’ADN intégré est observée pour les mutants S255A et S24A/S255A par rapport au WT (figure 65). Ces résultats sont en accord avec l’augmentation du nombre de cellules infectées décrite précédemment pour ces deux virus mutants. Quant aux autres mutants, ils présentent un nombre de copie d’ADN intégré similaire au WT (figure 65).

L’augmentation de l’infection des mutants S255A et S24A/S255A s’accompagne donc d’une stimulation de l’intégration.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 A DN in té g ré ( %) * *

Figure 65. Quantification de l’ADN intégré pour les virus WT et mutants dans les cellules 293T.

Les cellules 293T sont infectées comme précédemment puis cultivées pendant 14 jours. l’ADN est extrait et utilisé pour la qPCR. Le nombre d’ADN intégré/cellule est rapporté en prenant le nombre de copies d’ADN intégré pour le virus WT comme référence. Ces résultats sont la moyenne d’au moins trois expériences indépendantes. Les différences significatives par rapport au WT sont déterminées par un test de Student. *p<0.05

c.

Une augmentation de l’intégration est observée avec les mutants S255A et S24A/S255A. Afin de déterminer si c’est l’intégration ou une étape en amont qui est stimulée, l’ADN reverse transcrit dans les cellules infectées par le WT ou les virus mutés est quantifiée par PCR quantitative (voir Matériels et Méthodes, section 2.3 c)). Les cellules 293T sont infectées comme précédemment avec les virus WT et mutants. Sept heures après l’infection, l’ADN est extrait. L’étape d’intégration a lieu à partir de douze heures après l’infection, à sept heures nous récupérons donc l’ADN viral issu de la reverse transcription qui n’est pas encore intégré.

Nous constatons sur la figure 66 que les mutants ont un niveau d’ADN reverse transcrit équivalent au WT. Que ce soit pour le virus S255A ou S24A/S255A, la quantité d’ADN reverse transcrit est comparable à celle du virus WT. L’étape de transcription inverse n’est donc pas modifiée lorsque l’IN ne peut pas être phosphorylée sur les sérines 24 et 255.

Phosphorylation de l’IN du VIH-1 0 50 100 150 200 250 A D N r ev erse tr an scr it ( %)

Figure 66. Quantification de l’ADN reverse transcrit pour les virus WT et les mutants dans les cellules 293T. Les cellules 293T sont infectées comme précédemment pendant 7 heures. Puis

l’ADN est extrait et utilisé pour la qPCR. Le nombre de copies d’ADN total est représenté en prennant le WT comme 100 %. Ces résultats sont la moyenne d’au moins trois expériences indépendantes. Les différences significatives par rapport au WT sont déterminées par un test de Student. *p<0,05

3.3. Rôle de LEDGF/p75 sur la phosphorylation de l’IN

Lorsque les mutations S255A et S24A/S255A sont introduites dans l’IN, une augmentation du nombre de cellules infectées est observée. De manière intéressante, ces mutations augmentent l’intégration mais pas l’étape en amont de transcription inverse. Ces résultats montrent que lorsque l’IN n’est pas phosphorylable, l’étape d’intégration est stimulée.

Le cofacteur cellulaire de l’intégrase le plus étudié est LEDGF/p75. Ce facteur est connu pour stimuler l’intégration in vitro, augmenter la stabilité et l’oligomérisation de l’IN, être impliqué dans la translocation nucléaire de l’IN et enfin permettre le ciblage de l’intégration dans les unités de transcription actives (UTs). Etant donné le rôle très important de LEDGF/p75 lors de l’intégration, nous nous sommes demandés si LEDGF/p75 pouvait moduler la phosphorylation de l’IN par GCN2

GCN2-P

LEDGF/p75-P

IN-P

Pour cela nous avons réalisé un test de phosphorylation de l’IN en présence de LEDGF/p75 (figure

67 (a)). GCN2, comme nous l’avons préalablement montré, est capable de phosphoryler l’IN du

VIH-1 in vitro (piste 1). En revanche, nous n’observons pas de phosphorylation de LEDGF/p75 par GCN2 en absence d’IN (piste 2). Lorsque les trois protéines sont réunies, l’IN est très peu phosphorylée alors que LEDGF/p75 est phosphorylé par GCN2 (piste 3). L’interaction IN-LEDGF/p75 semble bloquer la phosphorylation de l’IN in vitro et au contraire permettre la phosphorylation de LEDGF/p75.

Pour tester si l’interaction IN-LEDGF/p75 est importante, le même test de phosphorylation avec les trois partenaires a été réalisé avec un mutant de LEDGF/p75 qui perd l’interaction avec l’IN (LEDGF/p75 D366N, don de M. Lavigne). La figure 67 (a) montre que la phosphorylation du mutant D366N de LEDGF/p75 est moins importante que celle de LEDGF/p75 WT. De plus la phosphorylation de l’IN n’est pas inhibée en présence de ce mutant de LEDGF/p75. Ces résultats prouvent que l’interaction entre l’IN et LEDGF/p75 est importante pour la phosphorylation de LEDGF/p75 par GCN2. Nous suggérions qu’un complexe à trois partenaires avec l’IN en position centrale existe in vitro.

Figure 67. Phosphorylation in vitro de l’IN en présence de LEDGF/p75. (a) Le test de

phosphorylation est réalisé comme précédemment mais avec 350 nM de LEDGF/p75. Piste 1: IN + GCN2. Piste 2: LEDGF/p75 + GCN2. Piste 3: IN + LEDGF/p75 + GCN2. (b) test de phosphorylation de l’IN en présence de LEDGF/p75 WT ou D366N. Piste 1 : IN + GCN2. Piste 2: IN + LEDGF/p75 WT + GCN2. Piste 3: IN+ LEDGF/p75 D366N + GCN2.

IN-P GCN2-P LEDGF/p75-P 1 2 3 a b 1 2 3

Phosphorylation de l’IN du VIH-1

L’interaction entre LEDGFp75 et l’IN in vivo est impliquée dans le transport de l’IN dans le noyau, permet d’augmenter la stabilité de l’intégrase et est importante pour que l’intégration se fasse dans les UTs. Nous avons montré que la présence de LEDGF/p75 entraîne une diminution de la phosphorylation de l’IN par GCN2 et que lorsque l’IN ne peut pas être phosphorylée par GCN2 in

vivo, une augmentation de l’infectivité et de l’intégration est observée. C’est pour cela que nous

avons décidé d’étudier l’effet de la phosphorylation de l’IN sur la localisation nucléaire, sur la stabilité de l’IN et enfin sur le ciblage de l’intégration.

a.

Nous observons une augmentation du nombre de cellules infectées pour les virus mutants S255A et S24A/S255A. Nous avons montré que pour ces deux mutants l’étape de transcription inverse n’est pas modifiée, tandis que le nombre d’évènement d’intégration dans la population cellulaire totale est augmenté. Ces résultats suggèrent que l’intégration est plus efficace lors de l’infection avec les mutants S255A et S24A/S255A. L’absence de phosphorylation de l’IN pourrait avoir un effet sur sa localisation cellulaire ce qui pourrait expliquer ces résultats.

Nous avons montré que l’INs-EGFP (IN synthétique) exprimée dans des cellules 293T était phosphorylée sur la S24 et la S255. Les mutations sur la S24 et la S255 ont donc été introduites par mutagénèse dirigée sur le pEGFP-C2-INs WT. L’INs est ainsi fusionnée à l’EGFP, ce qui nous permet de suivre sa localisation cellulaire. Dans des plaques 12 puits, 150 000 cellules sont préalablement déposées sur des lamelles. Le lendemain les cellules sont transfectées avec 1 µg des plasmides pEGFP-C2-INs WT et mutants. Vingt quatre heures après transfection les cellules sont fixées puis la lamelle est déposée sur une lame de microscopie pour être analysée.

Nous observons une localisation préférentielle de l’INs WT dans le noyau (figure 68). Cette localisation de I’IN exprimée dans les cellules 293T est conforme à ce qui est décrit. D’autre part, toutes les INs-EGFP portant les mutations sur les sites phosphorylés par GCN2 sont retrouvées au noyau de manière similaire à l’IN WT. Les mutations sur la S24 et/ou la S255 ne modifient donc pas le transport de l’IN dans le noyau.

IN S24A IN S24D IN S255A IN S255D IN WT Dapi EGFP Merge IN S24A/SS255A IN S24D/SS255D

Figure 68. Localisation cellulaire des INs-EGFP WT et mutées dans les 293T. Les INs-EGFP WT et

mutées sont surexprimées pendant 24h. Le noyau est marqué au DAPI.

b.

Pour observer si la stabilité de l’IN était modifiée par la phosphorylation, les niveaux d’expression des doubles mutants l’INs-EGFP S24A/S255A et de l’INs-EGFP S24D/S255D ont été comparés à celui de l’INs-EGFP WT. Dans un premier temps, les cellules ont été lysées, et 10 µg de protéines totales sont déposées sur gel et analysées par Western Blot avec un anticorps anti-EGFP (figure 69

(a)). Le contrôle de charge a été réalisé avec l’anticorps anti-actine. Aucune bande aspécifique

Phosphorylation de l’IN du VIH-1

1 2 3 4

actine