Conclusions et discussions

4.1. Interaction IN/GCN2

L’identification de l’interaction entre l’IN et GCN2 a dans un premier temps eu lieu dans le cadre d’une expérience de double hybride réalisée à partir d’une banque génomique de levure. L’interaction avec GCN2 humaine a ensuite été confirmée par co-immunoprécipitation. Aucun domaine minimum d’interaction sur l’IN n’a pu être identifié. Cependant, nous avons montré que l’IN se lie au niveau du domaine pseudokinase de GCN2.

Une collaboration avec l’équipe du Dr Carmelo Di Primo de l’IECB, à Pessac, a été mise en place pour étudier de manière plus approfondie l’interaction entre l’IN et GCN2 par résonance plasmonique de surface. Les premiers résultats confirment une interaction GCN2/IN avec des constantes d’association et surtout de dissociation très basses.

4.2. Activation de GCN2 par l’infection virale

Nous avons cherché à savoir si GCN2 était activée après l’infection par le VIH-1 par autophosphorylation. Dès les premières heures de l’infection par le VIH-1, la phosphorylation de GCN2 a été détectée par Western Blot. GCN2 est donc active dans nos conditions d’infection. De plus l’activation de GCN2 a également été observée dans le cadre d’une infection avec les lentivirus VIH-1 pseudo-typés VSV-g. Ceci montre que le processus d’activation n’est pas dépendant du mode d’entrée du virus.

Nos résultats ont été confirmés par ceux de l’équipe de Berlanga, qui ont montré très peu de temps après que nous ayons publié ce travail, que l’ARN viral du VIH-1 est responsable de l’activation de GCN2 [192]. Nos travaux permettent d’apporter un certain nombre d’informations concernant la région de l’ARN viral qui peut être impliquée. En effet, nous savons que les vecteurs lentiviraux VIH-1 pseudo-typés VSV-g entraînent une activation de GCN2 dans les cellules infectées. Ces derniers possédent un ARN contenant seulement certaines régions de l’ARN viral qui sont décrites dans la figure 51. La région activatrice de GCN2 est donc vraisemblablement incluse dans ces régions ce qui limite les zones de l’ARN à tester lors de futurs travaux.

Conclusions et discussions R U5 PBS RRE PPT PPT R ∆U3 Ψ

Figure 51. Représentation schématique de l’ARN viral encapsidé dans les lentivirus VIH-1. Les

boxes correspondent aux régions virales comprises dans l’ARNv des lentivirus

4.3. GCN2 est un facteur de restriction du VIH-1

Pour étudier le rôle de GCN2 au cours de l’infection par le VIH-1, nous avons utilisé des cellules dans lesquelles l’expression de GCN2 était éteinte par siRNA ou par « Knock Out ». En absence de GCN2, une augmentation de l’infectivité a pu être observée. La présence de GCN2 permet donc de limiter l’infection par le VIH-1.

4.4. La traduction de la cellule est inhibée après l’infection

Il a été montré que l’activation de GCN2 par l’infection virale du Sindbis Virus avait un effet restrictif sur l’infection, en inhibant la traduction cellulaire [190]. Puisque l’infection du VIH-1 s’accompagne d’une autophosphorylation de GCN2, nous avons cherché à savoir si la traduction était affectée suite à l’infection.

Dès les premières heures de l’infection, une diminution de la synthèse protéique est observée. L’extinction de GCN2 par siRNA permet de restaurer en partie la traduction des cellules infectées. L’activation de GCN2, lors de l’infection par le VIH-1, induit donc une inhibition de la biosynthèse des protéines.

Dans nos expériences, nous ne pouvons pas savoir si la traduction virale est également affectée. Cependant dans les travaux de Berlanga, un plasmide contenant un gène rapporteur codant pour la GFP sous la dépendance du promoteur viral est transfecté dans des cellules exprimant ou non GCN2. L’expression de la GFP et de la p24 est suivie par western blot avec des anticorps spécifiques (figure 52). Ces résultats montrent que l’absence de GCN2 restaure la traduction de la GFP et de la p24 (noRNAi ou RNAi3 vs RNAi4). La biosynthèse des protéines virales comme celle des protéines cellulaires est donc augmentée lorsque l’expression de GCN2 est diminuée. Cependant, la traduction des protéines virales n’est pas totalement inhibée en présence de GCN2

(no RNAi). A partir de ces résultats, nous pouvons supposer que la traduction du VIH-1 malgré l’activation de GCN2 est maintenue de manière partielle.

Figure 52. L’absence de GCN2 restaure la traduction des protéines du VIH-1.

L’expression de GCN2 est diminuée suite à une transfection stable de siRNA contre GCN2. Les cellules HeLa sont transfectées avec le plasmide pNL4-3.GFP.R-E-. Vingt quatre heures après la transfection, les protéines totales sont récupérées et analysées par Western Blot à l’aide des anticorps anti GCN2, eIF2α, GFP et p24 [192].

Nous savons que la traduction des protéines du VIH-1 peut se faire de façon coiffe-dépendante et lors de conditions particulière de façon IRES-dépendante. Il a été décrit que lors de condition de stress, la traduction coiffe-dépendante pouvait être inhibée tandis que la traduction IRES-dépendante était activée [55]. Sachant que la phosphorylation d’eIF2α inhibe spécifiquement la traduction coiffe-dépendante, la synthèse des protéines du VIH-1 pourrait avoir lieu de façon IRES-dépendante malgré l’activation de GCN2 et la phosphorylation d’eIF2α.

Cette hypothèse pourrait être vérifiée, grâce à l’utilisation de vecteur permettant de discriminer la traduction coiffe-dépendante de la traduction IRES-dépendante. Ainsi, nous pourrions savoir si suite à l’activation de GCN2, la traduction IRES-dépendante des protéines virales existe.

4.5. Restauration de la traduction

Une inhibition de la traduction des protéines est observée dès les premières heures de l’infection. Cependant à 24 heures après l’infection, malgré l’activation de GCN2, la biosynthèse des protéines totales est restaurée. Le virus a donc développé un mécanisme permettant de restaurer la traduction des protéines cellulaires et virales lors des étapes tardives du cycle viral.

Plusieurs mécanismes ont été décrits permettant aux virus de restaurer la traduction cellulaire et de maintenir la réplication virale. L’un d’eux est la présence d’une protéine virale qui interagit avec

Conclusions et discussions

GCN2 pour l’empêcher d’inhiber la synthèse protéique [194]. C’est pour cela que nous avons voulu savoir si l’interaction entre l’IN et GCN2 pouvait contrecarrer l’effet antiviral de GCN2.

L’IN a alors été transfectée dans des cellules cultivées dans des conditions normales ou soumises à un stress activant GCN2. Nous avons pu montrer dans un premier temps que la présence de l’IN n’entraînait pas d’inhibition de la traduction cellulaire. Cependant, l’IN est capable de restaurer en partie la traduction dans des cellules cultivées dans des conditions de carence en acides aminés. L’IN n’est donc pas un facteur responsable de l’activation de GCN2 mais par contre elle est impliquée dans la restauration de la traduction cellulaire.

L’équipe de Berlanga a mise en évidence une autre protéine virale importante pour contrecarrer l’effet de GCN2. En effet ils ont montré que GCN2 était dégradée in vivo trois jours après l’infection. La protéase virale est responsable du clivage de GCN2 [192]. Cependant cette dégradation n’a lieu que très tardivement, elle ne peut donc pas expliquer la restauration de la traduction que nous avons observée à 24 heures après l’infection.