L’intégrase du VIH-1

2.1. La structure

L’intégrase est exprimée et incorporée dans les virons comme une partie du domaine C-terminal du précurseur Gag-Pol. Elle est générée après clivage du précurseur par la PR, donnant une protéine de 288 acides aminés soit 32 kDa chez le VIH-1. Trois domaines de la protéine ont été identifiés par protéolyse partielle, par délétion et par complémentation in vitro de différents mutants : le domaine N-terminal (NTD), le core catalytique (CCD) et le domaine C-terminal (CTD) (figure 20). A ce jour aucune structure compète de l’IN du VIH-1 n’a pu être résolue cependant il existe des structures cristallographiques des domaines isolés et une structure complète de l’IN associée à ses substrats ADN en présence du cofacteur LEDGF/p75 par cryo-microscopie électronique [77, 78].

Figure 20. Organisation schématique de l’Intégrase du VIH-1. Adapté de [79]

a.

Ce domaine comporte un motif conservé HHCC analogue à un doigt de Zinc (figure 20). Il favorise la multimérisation de la protéine importante pour son activité catalytique. La structure du domaine NTD isolé a été obtenue en spectrométrie à Résonance Magnétique Nucléaire (figure 21

(a)) [80]. La structure du domaine N-terminal associé au core catalytique a été obtenue en 2001

par cristallographie [81] (figure 21 (b)). Le NTD est composé de trois hélices α. La fixation du Zn²⁺ via le motif HHCC stabilise les interactions entre les hélices et induit un repliement du domaine N-terminal. Un motif similaire aux motifs hélice-tour-hélice (HTH) est retrouvé, il est impliqué dans la multimérisation de l’IN. Fixation du Zinc Multimérisation Liaison à l’ADN Activité catalytique Multimérisation Liaison à l’ADN Liaison à l’ADN Multimérisation

Figure 21. Structure du domaine NTD seul et des domaines NTD-CCD de l’intégrase du VIH-1 (1-212) [82] [83] (a) Un monomère du domaine NTD de l’intégrase (PDB :1WJC). (b) Structure des

domaines NTD-CCD sous forme dimérique. La sous-unité A est en jaune et la sous-unité B est en vert. La triade catalytique DDE est en rouge (PDB : 1K6Y).

b.

Le domaine central ou catalytique est conservé parmi les intégrases rétrovirales, les rétrotransposons, les transposases. Il contient le site actif constitué par la triade catalytique D64, D116, E152 coordonnant deux ions Mg²⁺ requis pour l’activité catalytique de l’IN (figure 20). Les résidus Q148, Y143, K156, K159 sont importants pour l’interaction spécifique avec l’ADN viral. La mutation de deux d’entre eux, les Lysines 156 et 159, abolit l’activité.

La structure cristallographique de ce domaine a été obtenue grâce à l’introduction d’une mutation la F185K augmentant de manière significative la solubilité tout en conservant l’activité de la protéine (figure 22) [84]. La structure de ce domaine est issue d’un dimère en solution et est composée de cinq feuillets β, dont le second est antiparallèle aux autres, et de six hélices α [85]. Ce repliement est similaire à celui de la RNase H de la RT. Cette homologie de structure avec la RNase H a permis de classer l’IN dans la famille des nucléases et des polynucléotidyl transférases. Ce domaine est impliqué dans l’interaction avec LEDGF/p75, cofacteur important pour le ciblage de l’intégration in vivo comme nous allons le voir plus tard.

Figure 23. Structure du domaine CCD seul [82].

Structure cristallographique d’un dimère d’IN. Les résidus Asp64 et Asp116 de la triade catalytique sont représentés en rouge (PDB : 1THG).

B)

L’intégrase du VIH-1

c.

Cette région de l’intégrase est la moins conservée des intégrases rétrovirales. Sa structure a été résolue par RMN (figure 23 (a)) [86]. Ce domaine est composé de cinq feuillets β formant deux feuillets β antiparallèles ainsi qu’un domaine similaire au SH3. Le domaine SH3 pour Sarc Homology Domain 3 est en particulier connu pour fixer des molécules d’ADN. Il a été montré qu’il possède une activité de liaison non spécifique à l’ADN et que la délétion de ce domaine affecte les activités de 3’-end processing et de transfert de brin. Le domaine CTD est également impliqué dans la multimérisation de l’IN.

.

Figure 23. Structures du domaine CTD seuls et des domaines CTD-CCD de l’intégrase du VIH-1

[82, 83]. (a) structure RMN d’un dimère de CTD (PDB: 1IHV). (b) Structure des domaines CTD-CCD. La sous-unité A est en jaune et la sous-unité B est en vert. La triade catalytique DDE est en rouge. (PDB : 1EX4)

Même si les domaines de l’intégrase ont été cristallisés seuls ou deux à deux (la structure NTD/CCD (figure 21 (b)) et la structure CCD/CTD (figure 23 (b)), il est difficile de prédire comment s’arrangent les différents domaines entre eux. Des données sur la structure de l’intégrase entière du VIH-1 permettraient une meilleure compréhension de ses mécanismes catalytiques

d.

Récemment, la structure entière de l’intégrase du Prototype Foamy virus (PFV) associée à son substrat ADN pré-processé, complexe baptisé intasome, a été obtenue par cristallographie et diffraction aux rayon X [87, 88]. A l’heure actuelle c’est le seul intasome rétroviral pour lequel nous avons une structure cristallographique. L’alignement des séquences de l’IN de PFV avec celle

b

d’IN du VIH-1 démontre une haute conservation des éléments structuraux ce qui en fait un bon support pour la modélisation de la structure de l’intasome du VIH-1 [89].

Il faut savoir que l’IN de PVF mais pas du VIH-1, contient un quatrième domaine en N-terminal que l’on nomme le domaine extension N-terminal (NED) (figure 24 b)).

L’intasome de PFV est composé d’un dimère de dimères d’IN, et chaque monomère au sein du dimère joue un rôle distinct. Dans chaque dimère, les CCD des monomères internes (Vert et Bleu) sont en contacts avec l’ADN viral tandis que les CCD des monomères extérieurs stabilisent la structure de l’intasome [87, 89] (figure 24 a)). L’interface entre les dimères est stabilisée par des interactions intermoléculaires antre le NTD et le CCD.

Le problème de cette structure est que seul les CCD des domaines extérieurs ont été résolus. L’hypothèse quant au rôle de ces domaines extérieurs est qu’ils seraient impliqués dans la stabilisation du tétramère d’IN [90]

c

Figure 24. Structure de l’intasome de PFV [91] (a) Les domaines internes impliqués dans la liaison

à l’ADN viral sont en vert et bleu. Les domaines extérieurs sont en jaunes. L’ADN viral pré-processé est en orange et violet. La triade catalytique DDE est représentée en rouge. Les petites sphères grises correspondent aux atomes de Zn. (b) les sous unités internes de l’IN engagés dans la liaison avec l’ADN ainsi que les linkers sont représentés en vert.

L’organisation de l’intasome du VIH-1 complexé avec le cofacteur LEDGF/p75 a été obtenue par cryo-microscopie électronique [77]. Ces résultats confirment que chaque dimère d’intégrase fixe un cofacteur LEDGF/p75.

L’intégrase du VIH-1

2.2. Mécanisme d’action de l’intégrase

L’intégration in vivo de l’ADN proviral dans le génome cellulaire est une étape clé du cycle rétroviral. Elle nécessite trois réactions consécutives : le 3’-end processing qui a lieu dans le cytoplasme, puis le transfert de brin ayant lieu dans le noyau et enfin une étape de réparation des sites d’intégration. Les deux premières étapes sont catalysées par l’IN et peuvent être reproduites

in vitro permettant ainsi d’étudier les mécanismes d’action de l’IN (pour une revue [79]).

a.

L’IN se fixe de manière séquence spécifique sur les extrémités LTRs du génome viral synthétisé par la RT. L’IN catalyse alors la première étape de l’intégration : le 3’-end processing (figure 25). Cette étape est une réaction de digestion endonucléotidique au cours de laquelle l’IN clive un dinucléotide GT libérant ainsi des extrémités CA 3’OH rentrantes. Cet ADN viral après l’étape de processing sert alors de substrat pour la seconde réaction : le transfert de brin.

b.

Après translocation du CPI dans le noyau, l’IN catalyse la seconde étape, le transfert de brin (figure

25). Suite à une attaque nucléophile des liaisons phosphodiesters de l’ADN génomique, l’IN

catalyse l’intégration de l’ADN viral via ses extrémités CA 3’OH rentrantes. Cette attaque nucléophile s’effectue en deux sites, localisés sur chacun des brins de l’ADN génomique, avec un décalage de 5 nucléotides dans le cas du VIH-1.

c.

Suite au transfert de brin, une étape de réparation est nécessaire pour assurer la continuité entre l’extrémité 5’ de l’ADN viral et l’extrémité 3’ de l’ADN cellulaire (figure 25). Après l’élimination des 2 nucléotides des extrémités 5’ de l’ADN viral, a lieu la liaison de ces extrémités virales avec les extrémités 3’ de l’ADN chromosomique ainsi que la réparation des gaps. Cette étape est réalisée par des enzymes cellulaires impliqués dans de nombreuses voies de signalisation de réparation de l’ADN. Néanmoins, la nature exacte de ces protéines n’est toujours pas élucidée.

Figure 25. Schéma des étapes d’intégration in vivo. Adapté de [92]

d.

Les travaux de plusieurs équipes, dont la nôtre, montrent que différents état d’oligomérisation contrôlent les activités de l’IN. L’interaction de l’IN avec l’ADN viral au niveau des LTRs favorise sa dimérisation permettant le processing [93]. Ensuite les deux dimères de chaque extrémité interagissent ensemble formant un tétramère actif catalysant l’intégration concertée [94]. L’activité de l’IN est donc très dépendante de son état d’oligomérisation. En solution l’IN existe sous forme d’un équilibre entre monomères, dimères et des formes de plus haut poids moléculaires dont les tétramères [95].

Cytoplasme Noyau Transfert de brin Réparation de l’ADN 3’Processing

L’intégrase du VIH-1

2.3. Activités de l’intégrase in vitro

a.

L’essai in vitro du 3’ end processing reproduit la première étape de l’intégration. Un substrat de 21 nucléotides marqué au phosphore radioactif (P³²) en 5’ contenant la séquence de l’extrémité U5 du LTR viral est clivé par l’IN. Cette réaction aboutit à la formation d’un produit de 19 nucléotides (figure 26 (a)). Les produits de la réaction sont visualisés après électrophorèse sur un gel de polyacrylamide.

In vitro, l’IN catalyse le transfert de brin à partir d’un substrat radioactif marqué en 5’ issu de la

réaction de 3’end processing ou pré-processé (figure 26 (b)). Cet ODN sera intégré dans un autre ODN par l’IN. Les produits de la réaction sont visualisés sur gel de polyacrylamide, l’insertion se faisant de manière aléatoire les produits obtenus seront de différentes tailles.

Figure 26. Activité catalytique de 3’-end processing (a) et de transfert de brin (b) de l’IN du VIH-1

[96]

b.

Une troisième réaction, la désintégration est observée seulement in vitro [97]. Elle peut être considérée comme la réaction inverse du transfert de brin. Elle se fait à partir d’un substrat marqué radioactivement mimant le produit d’intégration d’une extrémité virale dans un brin d’ADN cible (figure 27). L’ADN viral est clivé par l’IN. Contrairement aux réactions de 3’-end processing et de transfert de brin, celle-ci peut être catalysée par les domaines catalytiques seul ou les protéines tronquées NTD-CCD et CCD-CTD.

3’Processing Désintégration