Le cycle réplicatif

2 3 4 5 5 6 7

6

7

8

Vpr est également impliqué dans le passage de la phase S à G2 lors du cycle cellulaire, dans la régulation de l’apoptose et enfin dans la transactivation des LTR viraux.

Vif

Vif est une protéine hautement exprimée dans les cellules infectées. Il a été montré que Vif interagit avec la cytosine désaminase APOBEC3G qui est un facteur cellulaire de restriction à l’infection par le VIH-1 dans les cellules non permissives [31]. Vif en se liant à APOBEC3G induit sa dégradation par le protéasome permettant ainsi l’infection dans des cellules non permissives [32].

Nef

Nef est hautement conservée au sein des lentivirus de primate. Ses principales fonction est d’inhiber l’expression de plusieurs récepteurs cellulaires : CD4, CD8, CD28, le CMH-I et le CMH-II ce qui modifie la transduction de signaux cellulaires [28].

1.3. Le cycle réplicatif

Le cycle réplicatif du VIH-1 se déroule en plusieurs étapes divisées en deux parties : les étapes précoces (figure 13 de 1 à 4) et les étapes tardives (figure 13 de 5 à 7).

a.

L’entrée virale.

La première étape du cycle est l’entrée du virus dans la cellule hôte (figure 13 - étape 1). Cette étape commence par une interaction entre le virus et la cellule, suivie d’une fusion entre la membrane virale et la membrane cellulaire libérant le core viral dans le cytoplasme. L’entrée virale peut être divisée en plusieurs phases (figure 14).

Dans un premier temps a lieu une interaction entre la protéine virale gp120 et le récepteur CD4 [34]. Cette liaison entraîne un réarrangement des domaines variables de gp120 essentiel à l’étape suivante qui est l’interaction avec le corécepteur transmembranaire aux chémokines. Deux types de corécepteurs peuvent être impliqués : CCR5 et CXCR4. Les virus sont ainsi classés VIH X4, VIH R5 ou VIH X4/R5 en fonction du type de corécepteur qu’ils utilisent. En général seuls les virus R5 et X4/R5 peuvent être transmis entre les individus. Plus tard, lors de l’infection les virus X4 seront séléctionés, c’est ce que l’on nomme le tropisme.

La dernière étape de l’entrée est la fusion membranaire. La liaison avec le corécepteur induit l’exposition d’un peptide de fusion de gp41 qui s’insère dans la membrane de la cellule cible. La fusion complète se produit alors entre les membranes virale et cellulaire libérant la capside virale dans le cytoplasme [35]. Ces interactions entre le virus et les récepteurs cellulaires activent de multiples voies de signalisation intracellulaires impliquées en autre dans le réarrangement du cytosquelette, l’activation de la transcription (activation de NF-ΚB et NFAT), dans la survie cellulaire [36]

Figure 14. Etapes d’entrée du VIH-1 dans la cellule-cible. 1. L’entrée nécessite les protéines Env

comprenant les sous unités gp120 (bleus) et gp41 (rouges). 2. La liaison entre gp120 et CD4. 3. Le changement conformationnel de gp120 permettant son rapprochement avec le corécepteur. 4. Ce qui induit un changement de conformation permettant au peptide fusion de gp41 de s’insérer dans la membrane de la cellule induisant la fusion des deux membranes [35].

L’infection par le VIH-1

La transcription inverse

La transcription inverse consiste en une série de réactions enzymatiques permettant la synthèse d’un ADN double brin à partir de l’ARN viral (figure 13-étape 2). Cette étape est catalysée par la RT et a lieu dans le cytoplasme au sein d’un complexe appelé le complexe de transcription inverse (RTC) (figure 15).

Pour initier la transcription inverse, la RT du VIH-1 a besoin d’une matrice et d’une amorce qui est un ARNt cellulaire, l’ARNt^lys3. Cet ARNt^lys3 se fixe au niveau de la séquence PBS (primer binding site) située en 5’ de l’ARN viral (ARNv) et sert d’amorce à la RT pour la synthèse de l’ADN négatif jusqu’à l’extrémité 5’ de l’ARN. Un duplex ADN/ARN est ainsi généré [37]. L’activité RNase H de la RT dégrade l’extrémité 5’ de l’ARNv, exposant l’ADN négatif nouvellement synthétisé. Cette région d’ADN est alors transférée à l’extrémité 3’ de l’ARNv. Ce premier saut de brin a lieu grâce à la présence des séquences R répétées aux extrémités de l’ARNv. La synthèse de l’ADN négatif peut alors se poursuivre sur tout le brin, puis la RNase H dégrade le reste de l’ARN excepté les séquences PolyPurine Tract (PPT) riches en purines situées en 3’ et dans la région centrale. Ces régions PPT servent d’amorce pour la synthèse du brin positif d’ADN et seront éliminées au cours de l'élongation. Un second saut de brin permet l’hybridation des séquences PBS des deux brins d’ADN. La fin de la synthèse aboutit à un ADN double brin linéaire comprenant à ses extrémités les LTR composés des séquences U3/R/U5. Ces extrémités LTR étant le substrat pour l’étape d’intégration, la spécificité de clivage des extrémités U3 en 5’ et U5 en 3’ par la RNase H est importante pour la suite.

La transcription inverse dans la cellule se produit au sein du RTC en présence des protéines virales MA, CA, RT, Vpr et IN. Ces protéines virales pourront avoir un rôle de cofacteur au cours de cette étape. Il a notamment été montré que la NC est un régulateur important de la transcription inverse (pour une revue voir [38]).

Figure 15. Etapes de la transcription inverse du VIH-1 (figure issue de la revue [39])

La décapsidation

Suite à la fusion des membranes cellulaires et virales, la capside virale est libérée dans le cytoplasme (figure 13 – étape 3). A l’heure actuelle, les données tendent à dire que la décapsidation a lieu après l’entrée et avant l’import nucléaire, mais les avis divergent quant au moment et au lieu précis de cette étape.

Une des hypothèses est que le désassemblage de la capside a lieu immédiatement après la fusion à proximité de la membrane plasmique, sachant qu’il n’est pas exclu que ce désassemblage soit partiel [40]. La décapsidation serait alors déclenchée par un changement soudain d’environnement lié à l’entrée du virus dans la cellule hôte.

Dans un autre modèle, la décapsidation est séquentielle au cours du transport vers le noyau. Dans ce cas, l’activation du désassemblage serait due à des changements successifs de l’environnement cellulaire et à des interactions avec différents cofacteurs cellulaires.

Un troisième modèle propose que la décapsidation à lieu à proximité du pore nucléaire lorsque la transcription inverse est terminée [41]. La capside intacte offrirait un environnement propice à la transcription inverse avec une concentration élevée de RT tout en permettant des échanges de

L’infection par le VIH-1

petites molécules telles que les nucléotides [42]. Dans ce modèle, une transcription inverse complète est nécessaire pour induire la décapsidation.

De nombreuses études montrent que si la décapsidation a lieu trop tôt, la transcription inverse est inhibée. En effet, un facteur de restriction cellulaire TRIM5α est connu pour cibler la CA au protéasome. TRIM5α agit dans l’heure suivant l’infection et entraîne un désassemblage prématuré inhibant la RT. De plus des mutants de CA induisant une instabilité de la capside virale provoquent une décapsidation prématurée et une transcription inverse abortive. Ces données prouvent que le core viral doit rester plus ou moins intact au cours de la transcription inverse [13].

Le transport intracellulaire et l’import nucléaire

Le cytoplasme est un milieu très visqueux ne permettant pas le déplacement des macromolécules et notamment des particules virales par simple diffusion. Les virus doivent donc détourner les mécanismes cellulaires pour se déplacer dans le cytoplasme et atteindre le site de réplication. Dans le cas du VIH, il semblerait que le RTC se déplace le long des microtubules pour atteindre la périphérie nucléaire au niveau du centrosome.

Lorsque la transcription inverse est complète le RTC devient le complexe de pré-intégration (CPI). Il a été montré que ce complexe est composée de l’ADNc, de protéines cellulaires et virales (RT, IN, MA, Vpr, CA et NC) même si la composition exacte du CPI reste controversée [19]. Ce CPI une fois transporté à proximité du noyau doit franchir la membrane nucléaire. Le transport via les pores nucléaires (NPCs) est très sélectif, les molécules de diamètre de moins de 39 nm peuvent passer par diffusion passive, tandis que le passage de molécules de diamètre supérieur à 39 nm nécessite un transport actif [43]. Sachant que le CPI est un complexe de grande taille dont le diamètre a été estimé supérieur à 50 nm, son entrée dans le noyau nécessite un transport actif et donc l’interaction avec des protéines carrier spécifiques. Les protéines virales et la structure viral « ADN flap » ont été proposées comme importantes pour l’import nucléaire du CPI [44].

La structure ADN Flap de l’ADN complémentair reverse transcrit est décrit comme impliquée dans l’import nucléaire, cependant la mutation de cette structure ne bloque pas totalement l’entrée du CPI dans le noyau [45].

De plus, les signaux de localisation nucléaires (NLSs) présents dans la MA, dans l’IN et dans Vpr ont été décrits comme importants pour le recrutement de protéines impliquées dans le transport nucléaire [46–48]. Il semblerait que plusieurs mécanismes soient impliqués pour l’import nucléaire du CPI.

L’intégration du génome viral

L’intégration est une étape clef du cycle viral permettant l’insertion stable de l’ADN viral dans le génome cellulaire rendant possible l’expression des gènes viraux et le maintien de l’information génétique lors de la division cellulaire. Cette étape est catalysée par l’IN. Le cofacteur cellulaire le plus étudié de l’intégration est LEDGF/p75. Les différentes étapes de l’intégration seront d’avantages décrites ainsi que les partenaires impliqués dans le la partie 2 intégrase du VIH-1.

b.

Une fois intégré, le provirus sert de matrice pour la transcription des ARNm viraux qui seront pour certains traduits en protéines et d’autres seront encapsidés pour devenir les génomes des nouvelles particules virales.

Transcription et export nucléaire des ARNm viraux

Les LTR contiennent des sites de liaisons pour plusieurs facteurs de transcriptions incluant NF-Kb, NFAT, Sp1 et AP1 ainsi que des signaux de polyadénylations. En amont du site d’initiation de la transcription (InR), des signaux types TATA box et des sites de liaison pour SP1 permettent le recrutement correct de l’ARN polymérase II au site d’initiation de la transcription [49]. En 3’ de cette région est présente une structure ARN, l’élément transactivating-responsive region (TAR) sur lequel se fixe la protéine Tat [50]. Tat recrute au niveau de TAR l’activateur de la transcription P-TEFb (positive transcription elongation factor b) constituée des deux sous unités CDK9 et CycT1. L’interaction entre Tat et P-TEFb induit un changement de conformation de CDK9 activant P-TEFb. Une succession de phosphorylations se produit alors et CDK9 phosphoryle le domaine CTD de l’ARN pol II permettant de passer d’un état d’initiation à un état d’élongation de la transcription et donc de finir l’élongation de l’ARN viral [51].

L’ARN polymérase II produit des transcrits ARN coiffés en 5’ et polyadénylés en 3’. Contrairement à beaucoup d’ARNm cellulaires, une partie des transcrits pour le VIH-1 sont non épissés (figure

16). Les ARN multi épissés sont exportés vers le cytoplasme de manière indépendante de Rev via

le système d’export des ARN messagers cellulaires, ce qui permet la production dans le cytoplasme des protéines régulatrices Rev, Nef et Tat [50]. Quant à l’export nucléaire des ARNm non épissés ou mono-épissés, il nécessite la présence de la protéine Rev qui se lie à l’élément Rev Responsive Element (RRE) permettant l’export des ARNm viraux [33]. L’ARNm non épissé, par la

L’infection par le VIH-1

suite servira aussi bien comme matrice pour la traduction ou comme ARN génomique qui sera encapsidé dans les nouveaux virons produits [53].

Figure 16. Transcription du VIH-1. Le génome viral contient plusieurs ORFs codant pour seize

protéines, issus d’au moins dix transcrits. Les lignes noires correspondent aux transcrits épissés et non épissés. Le point rouge correspond au codon d’initiation de la traduction. Adapté de [49].

Traduction

La traduction de l’ARN génomique peut se faire de manière coiffe-dépendante ou Internal Ribosome Entry Sequence (IRES) dépendante.

L’initiation coiffe-dépendante est utilisée communément par les ARNm eucaryotes. Le complexe eIF4F se fixe à la structure coiffe en 5’ de l’ARNm permettant le recrutement de la machinerie de traduction. La sous unité 40S du ribosome procède alors au scan de l’ARNm de 5’ en 3’ jusqu’au codon d’initiation AUG. Mais la traduction coiffe-dépendante est ralentie par la présence de la région 5’UTR de l’ARN viral qui est longue et hautement structurée [54]. L’ARNm gag non épissé ainsi que les ARNm mono épissés partageant le même 5’UTR, tous deux sont donc de mauvais substrats pour la traduction coiffe dépendante.

épissé Non épissé mono épissé vpr vpu RRE Rev dépendant Rev indépendant

Le VIH-1 a donc développé un mécanisme d’initiation de la traduction coiffe-indépendante. Le virus possède plusieurs séquences IRES une en 5’UTR et une autre dans la région codante de gag. Ces IRES permettent le recrutement de la sous unité 40S indépendamment de la liaison du complexe eIF4F à la structure coiffe.

Une des hypothèses serait que les rétrovirus utilisent les deux modes d’initiation, coiffe-dépendant et IRES-coiffe-dépendant, selon les conditions cellulaires pour favoriser la traduction de leurs protéines et leur réplication. En effet la traduction coiffe-dépendante peut être inhibée lors de différents stress cellulaires tels que l’hypoxie, les infections virales, l’apoptose. Il a été montré que dans ces conditions de stress la traduction des ARNm du VIH n’est pas perturbée et se fait de façon IRES-dépendante [55].

L’ARNm génomique entier sera traduit en deux précurseurs le Pr55^gag et le Pr160^gag-pol. La synthèse du précurseur gag-pol se produit suite à un décalage de lecture en -1. Ce décalage existe dans environ 5% des cas et permet la production d’un précurseur gag-pol pour 20 précurseurs gag. Deux éléments sont essentiels pour ce phénomène. L’héptanucléotide UUUUUUA et une structure tige-boucle situés à environ 200 nucléotides en amont du codon de terminaison [56].

Assemblage et bourgeonnement

La formation de nouvelles particules virales se produit selon plusieurs étapes faisant intervenir le précurseur Gag. Ce processus inclut la liaison de Gag à la membrane plasmique (MP), suivi de sa multimérisation, l’encapsidation de l’ARN génomique et l’incorporation des protéines Env [57]. Le ciblage de Gag à la MP nécessite la présence d’un domaine hautement basique myristilé en N-terminal de la MA.

L’assemblage se poursuit par le bourgeonnement des particules virales à la MP de la cellule. Ce bourgeonnement est initié par l’oligomérisation de Gag et est complété par la machinerie cellulaire incluant notamment le complexe Endosomal Sorting Complex Required for Transport-I et III (ESCRT) ainsi que les facteurs associés (figure 17) [58].

Si le Pr55^Gag est suffisant pour la production de Virus-Like Particules (VPLs) immatures, la production de particule mature nécessite l’encapsidation d’ARN et l’incorporation des glycoprotéines Env et du précurseur Gag-Pol. L’encapsidation de l’ARN est possible grâce à une interaction entre la NC et le signal d’encapsidation Psi (Ψ) présent sur l’ARNv en 5’ [57]. Deux copies d’ARNv sont sélectivement encapsidées et sont liées de manière non covalente via une séquence située dans le 5’UTR appelée signal d’initiation de dimérisation (DIS). La dimérisation de l’ARNv est importante pour l’infectivité des particules virales produites [14].

L’infection par le VIH-1

Figure 17. Assemblage et bourgeonnement des virus à la membrane plasmique. [58]

Maturation des particules virales

Les virus immatures non infectieux produits subissent une ultime étape de maturation pour devenir infectieux (figure 18). Cette étape passe par le clivage des précurseurs par la protéase virale. La protéase fonctionne comme un homodimère. Suite à l’interaction entre deux molécules gag-pol, le dimère de PR formé est instable et faiblement actif. Dû à cette faible activité, le premier clivage effectué par la PR est intramoléculaire permettant ainsi la libération du domaine N-terminal en amont de la PR [59]. Ceci augmente la stabilité de la PR ainsi que son activité favorisant les clivages intermoléculaires. Les clivages réalisés par la protéase se déroulent dans un ordre précis afin de former des virions infectieux (figure 19). En effet des mutations de la PR altérant l’ordre de clivage inhibent de manière drastique l’infection virale [60].

Une activation prématurée de la PR comme lors de la surexpression du précurseur gag-pol entraîne un processing précoce conduisant à une diminution de la production virale. D’autre part, l’expression d’une PR inactive aboutit à la production de virus non infectieux démontrant que des protéases cellulaires ne peuvent pas prendre le relais. L’activation de la PR est donc une étape critique et qui doit être hautement régulée.

L’assemblage, le bourgeonnement et la maturation sont étroitement liés. La cinétique de ces évènements n’est pas résolue à l’heure actuelle. Suite à l’initiation de l’assemblage à la MP, des

Pr55gag 1er clivage 2ème clivage 3éme clivage MA CA NC p6

virions complets sont observés après 5-10 min à la surface des cellules, et le relargage des virus existe 15-20 min plus tard [61]. Mais le moment où l’initiation de la maturation a lieu reste à être élucidé.

Figure 18. Section centrale d’une reconstruction tomographique de Cryo-microscopie électronique (a) d’une particule immature et (b) d’une particule mature [14] .

Figure 19. Clivage du précurseur gag. Processus séquentiel de clivage de gag par la protéase virale

[58].

1.4. Les facteurs de restrictions

Il existe chez l’hote, des systèmes de défense contre les infections rétrovirales qui font intervenir des facteurs de restriction. En parallèle les rétrovirus ont évolués pour échapper à ce système de défense grâce à des protéines virales antagonistes.

L’infection par le VIH-1

a.

En 2004, il a été montré que la forme de TRIM5α retrouvée chez le macaque était responsable du bloquage de la réplication du VIH-1 chez le singe. Tandis que la forme humaine de TRIM5α n’inhibe pas la réplication virale [62]. Cette restriction nécessite une interaction entre TRIM5α et la CA virale [63, 64]. Cette interaction n’est possible qu’avec la CA sous forme multimérique [65]. Le mécanisme d’action précis reste encore à être élucidé, cependant l’inhibition aurait lieu avant la transcription inverse et serait dûe à une décapsidation précoce suite à l’entrée du virus ce qui perturberait la transcription inverse.

b.

APOBEC3G (A3G) est une cytidine désaminase qui catalyse la désamination des cytidines en uridines à partir de substrat ADN simple brin. Elle est incorporée dans les particules virales via sa liaison avec l’ARN viral [66]. A3G induit la désamination du brin négatif de l’ADN du VIH-1 au cours de la réplication ce qui résulte dans une hypermuation de G en A au sein de l’ADN virale double brins entraînant l’apparition de mutations dans les gènes viraux [67]. La protéine virale Vif se lie à A3G ce qui provoque la polyubiquitinylation d’A3G et sa dégradation par le protéasome [32, 68]. A3G n’est alors plus incorporé dans les virions qui sont alors infectieux.

c.

BST-2 aussi appelée tetherin est une protéine membranaire. Grâce à ses domaines d’ancrage à la membrane plasmique en N et C-terminal, BST-2 peut être associée simultanément à la membrane cellulaire et virale. BST-2 bloque alors le relarguage de nouveaux virions déficient pour Vpu [69]. Une interaction directe entre Vpu et BST-2 a été montrée qui est responsable d’une déplétion de BST-2 au niveau de la membrane cellulaire [70]. De manière intéressante VIH-2 utilise Env et SIV utilise Nef pour neutraliser l’effet restrictif de BST-2.

d.

SAMHD1 est hautement exprimée et induite par l’interféron dans les cellules myéloïdes telles que les macrophages, monocytes et cellules dendritiques. SAMHD1 restreint l’infection dans les cellules myéloïdes par le VIH-1. Elle hydrolyse les dNTP ce qui réduit la concentration cellulaire en dNTP. Cette diminution du pool de dNTP conduit à une diminution de la synthèse d’ADN viral et donc une inhibition de l’étape de reverse transcription [71]. La protéine Vpx retrouvée chez VIH-2 induit la dégradation de SAMHD1 par le protéasome [72]. Grâce à Vpx l’infection des cellules

myéloîdes par le VIH-2 est permise. Bien que Vpr et Vpx soient très proches et partagent de