• Aucun résultat trouvé

Cultures bactériennes Culture

MATERIELS ET METHODES

2.1. Cultures bactériennes Culture

Les bactéries DH5α et Rosetta sont cultivées à 37°C sous agitation (220 rpm pour une culture liquide) dans un milieu LB (Luria-Bertani : 1% bactotryptone, 0.5 % yeast extract, 0.5 % NaCl et 1.5 % agar si milieu de culture solide) avec ou sans pression de sélection (50 µg/ml d’ampicilline ; 25 µg/ml chloramphénicol).

Transformation

Les bactéries ont été rendues compétentes par méthode chimique selon Hanahan [200]. La transformation est basée sur un choc thermique des bactéries compétentes en présence de l’ADN plasmidique. 200 µl de bactéries sont incubées sur la glace pendant 30 min avec 100 ng de vecteur ou 10 ng de mélange de ligation. Ensuite le mélange est mis pendant 1 min 30 à 42°C. Pour l’expression phénotypique, 800 µl de LB sans antibiotique est ajouté et les bactéries transformées sont incubées 1h à 37°C sous agitation. La sélection des bactéries de fait sur boite LB agar complémenté de l’antibiotique correspondant au gène de résistance porté par le plasmide à 37°C pendant la nuit.

Extraction et purification de l’ADN plasmidique

Les plasmides ont été produits à partir de différentes quantités de culture de bactéries : 10 ml pour les minipreps, 250 ml pour les midipreps et 500 ml pour les maxipreps. Les extractions et les purifications ont été réalisées à l’aide des kits QIAprep Spin Miniprep et Plasmid Plus Midi Kit (QIAGEN). Les maxipreps ont été réalisées à l’aide du kit Nucleobon Xtra Maxi Plus EF (Macherey-Nagel). La purification des plasmides utilisés pour la transfection de cellules humaines sont réalisées en condition endotoxine free.

2.2. Cultures de cellules mammifères

Les cellules HeLa P4, HEK 293T, MEFs GCN2 +/+ et MEFs GCN2 -/- sont cultivées dans du milieu Dulbecco’s modified minimal essential medium (DMEM, Invitrogen) complémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (SVF, Invitrogen), 50 mg/ml de gentamicine (Invitrogen) (DMEM complet). 1 mg/ml de G418 (Invitrogen) est ajouté au milieu de culture cellulaire des cellules HeLa P4 permettant le maintien de l’expression du récepteur CD4. Les MEFs GCN2-/- sont sensibles aux stress oxydatifs, 55 µM de β-mercaptoethanol est donc additionné au milieu de culture. Les cultures sont réalisées à 37°C en présence de 5 % de CO2.

Méthodes

Quand les cellules deviennent confluentes, elles sont alors décollées grâce à une solution de trypsine-EDTA (Invitrogen) puis diluées au 1/10 dans le DMEM complet pour que les cellules soient à nouveau confluentes au bout de 3-4 jours.

a. Les virus : VIH-1

Production

Les virus de l’immunodéficience humaine de type 1 sont obtenus par une co-culture de cellules MT4 et H9 chroniquement infectées par le VIH-1 Laï comme décrit dans [201].

Infection

Les infections sont réalisées en laboratoire de confinement de type P3. Les cellules HeLa P4 sont utilisées pour étudier la réplication du VIH-1. Elles expriment le récepteur CD4 à leur surface et elles possèdent le gène LacZ sous la dépendance du LTR viral. Suite à l’infection par le VIH-1, le génome du virus est intégré et la protéine Tat est alors produite. Celle-ci va être capable de transactiver la transcription du gène LacZ codant pour la protéine β-Galactosidase (figure 40). L’activité β Galactosidase peut donc être mesurée par ajout d’un substrat de l’enzyme : le 4-methylumbelliferyl D-galactopyranoside ou 4-MUG (Sigma-Aldrich). Suite au clivage par la β-Galactosidase, ce substrat devient fluorescent et le produit formé sera quantifié grâce au cytofluor à 460 nm (PerSeptive Biosystems).

Les cellules sont mises en culture à raison de 10 000 cellules / puits dans des plaques 96 puits et en DMEM complet. Après 24 heures de culture, les cellules sont lavées avec du PBS et infectées avec des dilutions virales sériées dans un volume final de 200 μl de DMEM complet par puits. La révélation de l’infection se fait par ajout de tampon 4-MUG (50 mM Tris pH 8, 5 mM 4- MUG, 100 mM β-Mercatoéthanol, 0,05 % Triton X-100). Après 3 lavages des cellules au PBS, 200 μl du tampon 4-MUG est ajouté par puits. La plaque est incubée 24 h à 37°C, puis la lecture de l’activité β-Galactosidase se fait par mesure de la densité optique (DO) à 460 nm après excitation à 360 nm sur un cytofluor.

Figure 40. Modèle d’infection des cellules HeLa P4 et de quantification de l’infection virale. Les

cellules HeLa P4 expriment de manière constitutive le récepteur CD4 au niveau de la membrane cytoplasmique et sont transformées de façon stable avec le gène LacZ sous contrôle du promoteur viral LTR [198] Après reconnaissance de la cellule cible (1), le virus entre (2) et l’ARN viral est retro transcrit en ADN viral (3). L’ADN viral est acheminé dans le noyau et intégré au génome cellulaire (4). Les phases de transcription précoces permettent d’obtenir la protéine accessoire Tat (5) qui va permettre la transactivation du gène LacZ (en vert) sous contrôle du promoteur LTR (en gris) (6). La β-Galactosidase alors synthétisée (7) clive le substrat 4-MUG en un produit fluorescent (8) qui sera proportionnel au niveau d’infection et quantifiable par cytofluor à 460 nm.

b.

Les virus : les lentivirus pseudo-typés VSV-g

Production

Les particules lentivirales pseudo-typées VSV-g ont été produites par la plateforme de Vectorologie de Bordeaux.

Les cellules 293T sont ensemencées dans une boite de pétri de 10 cm (6 à 7.106 cellules) dans 10 ml de DMEM complet. Après 24 heures, les cellules sont transfectées avec les trois plasmides décrits ci-dessus. L’ADN (10 µg dans 450 µl d’eau) et du CaCl2 (50 µl de solution 2.5 M) sont filtrés (0.22 µm) puis versés goutte-à-goutte sur 500 µl de HBS 2X (280 mM NaCl ; 1.5 mM Na2HPO4-7H2O ; 100 mM HEPES pH 7.2). Après trois minutes, le mélange est dispersé de façon homogène sur les cellules. Quatre heures post-transfection le milieu est changé par du DMEM complet. Après 24 ou 48 heures, le surnageant de culture contenant les produits est récupéré et centrifugé 5 minutes à 2500 rpm. Le surnageant est filtré (0.22 µm) puis ultra-centrifugé à 20000 rpm

Méthodes

pendant 2 heures. Le culot viral est repris dans 1 ml de DMEM et aliquoté à raison de 100 µl par tube et conservé à – 80°C.

Titration

La titration des virus est réalisée par la plateforme de Vectorologie.

Titre infectieux

Les cellules 293T sont infectées avec des dilutions virales sériées puis la fluorescence de l’EGFP traduite est mesurée par cytométrie de flux. Le titre est calculé en réalisant une moyenne du pourcentage de fluorescence obtenu pour chaque dilution rapporté au nombre de cellules infectées pour une transduction inférieure à 20 %.

Dosage p24

La quantité de p24 présente dans le surnageant viral est dosée par ELISA (InGen - International Genetics Technologies).

Traitement DNase

Les plasmides utilisés pour la production peuvent contaminer le surnageant contenant les particules lentivirales, Le plasmide de transfert codant pour l’EGFP doit être donc éliminé pour éviter d’interférer avec les analyses d’infection. Les surnageants viraux sont ainsi traités pendant 1 heure à 37°C avec 40 U/ml de RNase free DNase (Promega) puis stockés à -80°C

Transductions

Les infections sont réalisées en laboratoire de confinement de type P2.

Des cellules mammifères HeLa P4, 293T ou MEFs sont utilisées pour réaliser les transductions avec les particules lentivirales pseudo-typées VSV-g. Les cellules sont mises en culture à raison de 50 000 cellules / puits dans des plaques 48 puits et en DMEM complet. Après 24 heures de culture, les cellules sont transduites avec différentes MOI dans un volume final de 200 μl de DMEM par puits. 48 heures après, les cellules sont rincées avec du PBS et 400 µl de milieu complet est ajouté. Après 72 heures d’infection, les cellules sont préparées pour être analysées par cytométrie de flux (BD FACSCanto; Cytometry Facility, SFR TransBioMed, Université de Bordeaux). Les cellules sont alors lavées 2 fois avec du PBS, décollées avec de la trypsine, puis 1 volume de PBS, 0,2 mM EDTA, 0,5 % SVF est ajouté.

c.

Transfection

Transfection des siRNAs

Les cellules sont mises en culture à raison de 50 000 cellules / puits dans des plaques 48 puits. La transfection est réalisée sur des cellules à 60-80 % de confluence. L’agent de transfection utilisé

est le sc-29528 (Santa Cruz biotechnology, Inc). 18 pmoles de siRNA GCN2 ou de siRNA contrôle (Santa cruz biotechnology, Inc) ont été transfectées. Les siRNAs sont dilués dans 50 μl final de DMEM. L’agent de transfection est dilué à raison de 3 μl dans 50 μl final de DMEM. Les 2 mélanges sont incubés 20 minutes à température ambiante pour permettre la formation des complexes siRNA-agent de transfection. Après incubation, 400 μl de DMEM sont ajoutés délicatement au mélange. 125 µl de ce mélange est déposé sur les cellules préalablement rincées au PBS. Après 4 heures d’incubation à 37°C, 125 μl de DMEM contenant 20 % de SVF sont ajoutés. Les cellules sont ensuite cultivées à 37°C en présence de 5 % de CO2.

Transfection des plasmides Cellules HeLa P4 et HEK-293T

Les cellules sont mises en culture à raison de 50 000 cellules / puits dans des plaques 48 puits. La transfection est réalisée sur des cellules à 60-80 % de confluence. L’agent de transfection utilisé est la lipofectamine 2000 (Invitrogen). 1 µg de plasmide est dilué dans 100 µl d’optiMEM. 1 µl de lipofectamine 2000 est ajouté dans 100 µl d’optiMEM. Les deux mélanges sont incubés pendant 15 minutes à température ambiante. Les cellules sont rincées avec du PBS puis la totalité du mélange de transfection est déposée sur les cellules. Après 4 heures d’incubation à 37°C, les cellules sont rincées et 400 µl de DMEM complet est ajouté. Les cellules sont ensuite cultivées à 37°C en présence de 5 % de CO2.

Cellules MEFs

Les MEFs étant plus difficilement transfectables par les méthodes classiques, nous avons utilisé la nucléofection. Le protocole mis au point permet d’obtenir 50-60 % cellules transfectées.

Les cellules sont mises en culture à raison de 150 000 cellules / puits dans des plaques 12 puits. La transfection est réalisée sur des cellules à 80 % de confluence. Les transfections se font par MagnetofectionTM (OZBIOSCIENCES).

Pour 1 µg de plasmide, 2 µl d’agent de transfection sont utilisés dans un volume final de 100 µl d’optiMEM. Le mélange ADN/lipofectamine est incubé avec 1 µl de billes CombiMag pendant 20 minutes à température ambiante. Le mélange de transfection est déposé sur les cellules et elles sont incubées 20 min sur une plaque magnétique à 37°C. Après 4 heures d’incubation à 37°C, le milieu de transfection est changé par 400 µl de DMEM complet. Les cellules sont ensuite cultivées à 37°C en présence de 5 % de CO2.

Méthodes

d.

Préparation des cellules pour le microscope

Dans des plaques 12 puits, 150 000 cellules sont préalablement déposées sur des lamelles. Le lendemain les cellules sont transfectées avec le pEGFP-C2-INs. 24 heures post-transfection les cellules sont lavées trois fois avec du PBS (140 mM NaCl ; 3 mM KCl ; 8 mM Na2HPO4 et 1,5 mM KH2PO4 pH 7,4), puis fixées pendant 10 min avec 500 µl de paraformaldéhyde 2 %. Pendant 5 min les cellules sont perméabilisées dans une solution de PBS 0,4 % saponine ; 0,1 % triton X-100. Après lavage au PBS, la lamelle est déposée sur une lame de microscopie avec 9 µl de solution de montage contenant le DAPI dilué au 1/100éme. Les lames sont alors observées au microscope droit à fluorescence AxioImager Z1.

2.3. Manipulations des acides nucléiques

a. Extraction des acides nucléiques de cellules infectées

Après l’infection, l’ADN total viral contenu dans les cellules humaines est extrait à l’aide du kit commercial QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN) selon les indications du fournisseur.

b. Mutagenèses dirigées

Les mutagénèses ont été réalisées sur le pET-21b-IN, pCMVΔ8.91 et le pEGFP-C2-INs à l’aide de l’enzyme Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Fermentas). Pour cela 100 ng de plasmide est incubé avec 0.5 µM d’amorces correspondantes, 200 µM dNTPs, 3 % DMSO et 10 µl de tampon HF 5X dans un volume final de 50 µl. Après une étape de dénaturation de 30 secondes à 98 °C, l’amplification est réalisée par 20 cycles (10 sec à 98 °C, 45 sec à 60 °C et 1 min multipliée par le nombre de kb du plasmide à 72 °C c’est-à-dire 6 min pour le pET-21b-IN et le pEGFP-C2-INs et 10 min pour le pCMVΔ8.91) suivie de 10 minutes à 72°C. Le produit de la PCR est incubé avec l’enzyme de restriction DpnI (Promega) dégradant les plasmides méthylés donc les plasmides sauvages. L’incubation avec 10 unités de DpnI se fait pendant 1 heure à 37 °C puis de nouveau 1 µl de DpnI est ajouté pendant 30 minutes à 37°C. Les bactéries DH5α sont ensuite transformées par les plasmides pour l’amplification et l’extraction de ces derniers. La qualité des plasmides est vérifiée sur gel d’agarose 1%.

c. Séquençage des plasmides

La séquence des plasmides doit être vérifiée notamment après la mutagenèse dirigée. Le séquençage est réalisé par le service de séquençage de MWG eurofilms. Pour ce faire 70 ng de plasmides et 2 µl d’amorce à 10 µM sont mélangés dans un volume final de 17 µl et envoyés chez MWG eurofilms. L’analyse des séquences se fait ensuite à l’aide du logiciel BioEdit.

d. PCR

PCR quantitative de l’ADN viral total

Les PCR quantitatives ADN total sont réalisés à l’aide du kit KAPA SYBR® FAST qPCR. L’ADN viral des lentivirus est réalisé par amplification d’un fragment du gène de l’EGFP. La réaction est réalisée avec 5 µL d’échantillon prédilué au 1/10, 1/100 et au 1/1000, 200 nM d’amorces lenti F et lenti R (tableau 10), 0.4 µL de ROX High et 10 µl de mix de réaction KAPA 2X dans un volume final de 20 µl. Après une étape de dénaturation à 95°C pendant 3 min, l’amplification est réalisée avec 42 cycles (3 sec à 95°C, 20 sec à 60°C et 20 sec à 72°C). L’étalonnage est réalisé en amplifiant des dilutions sérielles du plasmide de transfert servant pour la production des lentivirus.

PCR quantitative de l’ADN intégré

La détection de l’ADN intégré après infection avec les lentivirus se fait par PCR quantitative (protocole de la Plateforme de Vectorologie de Bordeaux). L’ADN viral est extrait des cellules 14 jours après l’infection et 50 ng d’ADN est utilisé ce qui permet d’éliminer les plasmides contaminants utilisés lors de la transfection ainsi que l’ADN viral non intégré. Les PCR quantitatives ont été réalisées à l’aide du kit TaqMan PCR Master Mix (Bio-Rad). L’ADN viral est quantifié par amplification d’un fragment de 69 pb du gène EGFP. La réaction est réalisée avec 20 µM d’amorces (EGFP.F :GCGCACCATCTTCTTCAAGG ; EGFP.R :GTGTCGCCCTCGAACTTCAC), 5 µM de sonde (CGGCAACTACAAGACCC) et 12.5 µl de tampon de réaction dans un volume final de 25 µl. Le programme contient après une étape initiale à 50°C pendant 2 min, une phase de dénaturation à 95°C pendant 10 min suivie de 40 cycles d’amplification (15 sec à 95°C, 1 min à 60°C). Pour chaque échantillon, l’amplification est réalisée sur une région spécifique du lentivirus (sonde lenti) et sur le gène de la RNase P utilisé comme contrôle endogène qui permet de normaliser et de vérifier l’efficacité de la PCR. Deux lignées cellulaires contrôles contenant soit un, soit trois provirus intégrés sont employées comme standard et permettent d'estimer le nombre de provirus intégrés par quantification relative. Les résultats sont obtenus par comparaison des ΔCt à la lignée contrôle (1 copie) après normalisation des Ct par rapport au gène endogène (RNase P).

e. Séquençage haut débit des sites d’intégration

Le protocole décrit ci-dessous de préparation des échantillons pour le séquençage haut débit a été mis au point à partir de l’article du Dr Angela Ciuffi [202].

Méthodes

L’ADN génomique de cellules 293T ou MEFs infectées est extrait à l’aide du kit commercial QIAamp DNA Blood Mini kit. La qualité de l’extraction est vérifiée sur gel d’agarose 1%.

Digestion MseI

L’ADN génomique est digéré par l’enzyme de restriction Mse1 NEB (New England Biolabs) sur la nuit à 37°C. Pour cela 2 µg d’ADN génomique est incubé avec 12 unités d’enzyme MseI, 20 µg de BSA, le tampon NEB2 dans un volume final de 200 µl

Purification de l’ADN digéré

Pour éliminer l’enzyme de restriction, l’ADN digéré est purifié sur les colonnes du kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). L’échantillon est divisé en deux et passé sur deux colonnes différentes. L’élution se fait dans 50 µl de Tris HCl 10 mM pH 8.0. Les éluats des deux colonnes sont rassemblés.

Préparation des linkers

20 µl de chaque « linker » Mse1 linker (+) et (-) préalablement dilués à 40 µM sont mélangés. Le mélange est dénaturé à 90°C pendant 5 min puis refroidi à raison de 1°C toutes les 3 min jusqu’à que la température atteigne 20°C. Le mix linkers est conservé à -20°C

Ligation des linkers

La ligation de l’ADN digéré avec le mix linkers est réalisée sur la nuit à 21°C selon le protocole suivant. 13,5 µl d’ADN issus de l’étape précédente est incubé avec 3,5 µl de mix linkers, 4 unités d’ ADN T4 ligase (promega) et le tampon ligase (promega) dans un volume final de 20 µl. La réaction de ligation est stoppée à 65°C pendant 15 min.

Digestion DpnI et SacI de l’ADN ligué

La digestion Dpn1 élimine les plasmides contaminants qui peuvent être présents suite à la production des lentivirus. SacI élimine les fragments internes qui correspondent aux jonctions LTR-ADN viral. La digestion se fait avec 20 µL d’LTR-ADN issus de l’étape de ligation, 0,5 µg de BSA, 40 unités de DpnI et de SacI (Proméga) dans le tampon J 10 X, dans un volume final de 50 µL, pendant 4 heures à 37°C.

PCR 1

Pour la première PCR, 5 µL d’ADN issus de la digestion est amplifié à l’aide de l’enzyme Phusion High Fidelity DNA Polymerase en présence 300 nM de primer LTR1 et MseL1, 250 nM dNTPs, 5 µl de tampon HF 5X et 3 mM de MgCl2. Le protocole de PCR pour les échantillons issus des cellules 293 T est une phase de dénaturation à 95°C pendant 2 min suivie de 25 cycles d’amplification (15

sec à 95°C, 30 sec à 55°C et 1 min à 72°C), pour les échantillons issus des MEFs une phase de dénaturation à 95 °C pendant 1 min suivie de 5 cycles (15 sec à 94°C et 1 min à 72°C), puis 20 cycles d’amplification (2 sec à 94 °C et 1 min à 67 °C).

Nested PCR

Le produit de la PCR1 est dilué au 1/50 et sera amplifié selon le même protocole que pour la PCR1 mais avec les primers MseL2 454 et LTR2 454 mid.

Précipitation des produits de nested PCR

50 réactions de nested PCR sont précipitées en présence de 2.5 vol éthanol absolue et 0.3 M d’acétate de sodium sur la nuit à -20°C. Le lendemain, l’échantillon est centrifugé 30 min à 4°C à 17 000 rpm et le culot est conservé pour la suite.

Purification sur gel (kit S.N.A.P UV-Free Gel Purification)

Pour le séquençage haut débit par la technologie Roche utilisant le 454 junior, il faut que nos échantillons aient une taille comprise entre 200 et 500 pb, c’est pourquoi les produits sont séparés sur gel puis purifiés à l’aide du kit S.N.A.P UV-Free Gel Purification (Invitrogen).

Le culot est repris dans 20 µl de cristal violet loading dye 6X fournis dans le kit. Les produits sont séparés sur un gel d’agarose 2 % en TAE colorée au cristal violet (1/250ème). Après migration, les fragments d’ADN compris entre 200 et 500 pb sont extraits sur gel. La purification des produits se fait alors selon les recommandations du fournisseur. L’élution se fait dans 25 µL de TE.

Les échantillons sont alors dosés et utilisés pour le pyroséquençage haut débit 454.

Analyse bioinformatique

Nous cherchons à savoir si les évènements d’intégration ont lieu dans des gènes. Pour cela, les séquences obtenues sont alignées sur le génome humain à l’aide du serveur en ligne UCSC genome Browser (https://genome.ucsc.edu/). Les critères d’inclusion des séquences sont : 1) elles contiennent les 3 derniers nucléotides du LTR viral, 2) elles s’alignent avec un score de 98 % avec le génome humain et 3) si elles s’alignent une seule fois avec l’ADN génomique.

Des sites théoriques appelés « matched random control » (MRC) sont générés pour éliminer les biais liés à l’utilisation de l’enzyme de digestion Mse1. Pour chaque site unique, sont générés in

silico 10 MRCs. Les MRCs sont placés de manière aléatoire dans le génome et sont à la même

Méthodes

d’intégration est comparée avec les MRCs à l’aide d’un test de chi 2 pour déterminer si l’intégration se fait de manière préférentielle dans les gènes.

2.4. La manipulation des protéines

a. Production de l’IN recombinante

Une préculture est réalisée en ensemençant une colonie de Rosetta fraîchement transformée avec le pET-21b-IN dans 20 ml de LB + ampicilline (100 µg/ml) + chloramphénicol (34 µg/ml) durant la nuit à 37°C sous agitation. Le lendemain, la préculture est ensemencée dans 500 ml de LB complémenté avec de l’ampicilline et du chloramphénicol. La culture se poursuit jusqu’à atteindre une DO à 600 nm de 0,6. L’induction de la production d’intégrase se fait par ajout d’IPTG (500 µM). La culture est laissée 3h à 37°C sous agitation. Les bactéries sont ensuite centrifugées 10 min à 4000 rpm à 20°C. Les culots sont congelés à - 80°C.

Tampons utilisés pour la cassure :

- Tampon de lyse : 50 mM HEPES pH 7,5 ; 5 mM EDTA pH 8 ; 1 mM DTT; 1 mM PMSF; inhibiteurs de protéases (Roche),

- Tampon de solubilisation : 50 mM HEPES pH 7,5 ; 1 M NaCl ; 1 mM EDTA; 1 mM DTT; 7 mM CHAPS.

Tampons utilisés pour la purification :

- LSC (low salt concentration) : 50 mM HEPES pH 7,6 ; 0,2 M NaCl ; 0,1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 7 mM CHAPS ; 10 % glycerol.

- HSC (high salt concentration) : 50 mM HEPES pH 7,6 ; 0.2 M NaCl ; 1 M sulfate d’ammonium, 0,1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 7 mM CHAPS.

- Tampon de dilution : 50 mM HEPES pH 7,6 ; 0,1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 7 mM CHAPS ; 10 % glycérol.

- Tampon HS : 50 mM HEPES pH 7,6 ; 1 M NaCl ; 0,1 mM EDTA ; 1 mM DTT ; 7 mM CHAPS, 10 % glycérol.

Les culots sont repris dans 20 ml de tampon de lyse avec du lysozyme (20 mg/ml) et de la DNase (15 μl/ml) (RQI RNase free Promega) pour détruire la paroi bactérienne et casser l’ADN. Après sonication à 60 W pendant 20 secondes, une centrifugation à 10 000 rpm pendant 10 min est ensuite réalisée. Le surnageant constitue la fraction soluble. Le culot est lavé dans 20 ml de tampon de lyse puis centrifugé. Le culot est repris dans 13 ml de tampon de solubilisation. Les

protéines sont solubilisées 1h à 4°C sous agitation légère et ensuite centrifugées 1 h à 33000 rpm. On obtient un « surnageant 33000 rpm ». Le surnageant est supplémenté avec du sulfate d’ammonium à une concentration finale de 1M et agité doucement 5 min à 4°C. On centrifuge 20