Quel est le rôle de Chk1 au sein du checkpoint de l’ADN chez Saccharomyces cerevisiae ?

Chez Schizosaccharomyces pombe et les cellules de mammifères, Chk1 est impliquée dans l’arrêt en G2. Suite à un stress génotoxique, elle inhibe, via la phosphorylation de différentes

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protéines, l’activation de Cdk1 requise pour l’entrée en mitose. Chez S. pombe, la délétion de CHK1 entraîne une forte sensibilité aux UV et aux rayons !. Ainsi, on arrive très facilement à mettre en évidence le rôle de Chk1 dans la réponse aux dommages de l’ADN chez cette levure comme chez les eucaryotes supérieurs. Comme nous l’avons déjà souligné, chez Saccharomyces cerevisiae, le rôle de Chk1 est considéré comme mineur puisque sa délétion ne montre pas de phénotype fort. Ainsi, le mutant chk1! n’est sensible ni au MMS, ni aux rayonnements UV et !

(Liu et al., 2000; Sanchez et al., 1999). Cette absence de phénotype marqué est spécifique de la délétion de CHK1, puisqu’elle ne caractérise pas la délétion des autres gènes connus du checkpoint de l’ADN chez la levure bourgeonnante.

Malgré l’absence apparente d’importance de cette protéine chez S. cerevisiae, il a été montré que Chk1 contrôlait une voie parallèle à celle contrôlée par Rad53. Ceci a été clairement mis en évidence uniquement à l’aide de la mutation cdc13-1. Cdc13 est une protéine qui protège les extrémités télomériques. La mutation cdc13-1 est thermosensible : les mutants ont une croissance normale à 23°C ; par contre, à température restrictive, ils accumulent de l’ADN simple-brin aux télomères et s’arrêtent en G2/M (Garvik et al., 1995). Cet arrêt est dépendant du checkpoint de l’ADN qui semble détecter la présence de cet ADN simple-brin et le traiter comme un dommage. Si les mutants cdc13-1 sont placés quelques heures à température restrictive, le retour à température permissive va permettre la formation de colonies viables. Par contre, s’ils restent à température restrictive, les cellules vont mourir sous forme de microcolonies (Maringele and Lydall, 2002; Sanchez et al., 1999). On peut parler dans ce dernier cas d’adaptation puisque les cellules arrivent tout de même à faire quelques divisions et donc à reprendre le cycle malgré la présence persistante de dommages. Cependant, les microcolonies après 16 heures à température restrictive sont petites : 90% d’entre elles ne comportent pas plus de 4 cellules (Sanchez et al., 1999). Ceci indique que la quantité de dommages dans ces cellules doit être importante limitant la possibilité d’adaptation. Ainsi, l’adaptation semble plus aisée dans le cas d’une cassure HO qu’en présence de la mutation cdc13-1.

La délétion de CHK1 supprime partiellement cet arrêt, tout comme la délétion de RAD53. En effet, le suivi de la progression dans le cycle de cellules cdc13-1 chk1! et cdc13-1 rad53!

relarguées à température restrictive après un arrêt à l’"-facteur montre que ces mutants ne maintiennent pas l’arrêt en G2/M et reprennent le cycle de façon précoce. La délétion concomitante de CHK1 et RAD53 supprime complètement l’arrêt en G2/M du mutant cdc13-1 (Sanchez et al., 1999). L’effet de la disruption de CHK1 sur l’adaptation du mutant cdc13-1 est important puisque l’on passe de 10% dans une souche sauvage à 90% de cellules pouvant former des microcolonies de plus de 4 cellules après 16 heures (Sanchez et al., 1999). Ceci est en accord avec nos résultats, puisque nous retrouvons nous aussi que la délétion de CHK1 entraîne une reprise précoce du cycle lors d’un arrêt prolongé imposé par le checkpoint de l’ADN suite à une cassure HO (dans les contextes ptc2! et yku80!) ou lors d’un traitement à la camptothécine

(contexte ptc2!).

Chk1 ne semble pas avoir un rôle primordial dans la mise en œuvre ou le maintien de l’arrêt dans un contexte sauvage. Quelques effets mineurs sont toutefois observés. Ainsi, la reprise du cycle semble légèrement plus précoce chez le mutant chk1! que chez la souche

sauvage après cassure HO ou traitement à la camptothécine (cf figures n°G10 et G12). De même, une autre étude sur des populations de cellules chk1! synchronisées montre un léger défaut du

maintien de l’arrêt en mitose 6 heures après une irradiation !, notamment lorsque les cellules ont été préalablement arrêtées avec du nocodazole. Dans cette étude, les auteurs soulignent le fait que l’établissement de l’arrêt en G2/M suite à l’irradiation est clairement détecté dans les cellules

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chk1! contrairement à ce que l’on observe par exemple chez les mutants rad17! et que la

délétion de CHK1 n’affecte donc que le maintien de l’arrêt (Liu et al., 2000). Ceci est encore une fois en accord avec nos résultats puisque nous n’observons pas non plus de défaut pour les cellules chk1! dans l’établissement de l’arrêt mais plutôt dans le maintien, que ce soit après

cassure HO ou après traitement à la camptothécine.

Il est intéressant de noter que seuls des défauts dans l’arrêt du cycle après un stress génotoxique ont été mis en évidence chez les délétants chk1!. Aucun défaut de viabilité n’a été

observé que ce soit après des dommages induits par des radiations UV, !, ou des traitements au MMS, à la camptothécine ou au 4-NQO (cf figure n°G12B, données non montrées et (Liu et al., 2000; Sanchez et al., 1999)). De même, la délétion de CHK1 n’influe pas sur le rétablissement du mutant cdc13-1, ou plus exactement sur sa viabilité après retour à température permissive (Sanchez et al., 1999). Il a naturellement été proposé que Chk1, au sein du checkpoint, n’intervienne qu’au niveau des mécanismes contrôlant l’arrêt du cycle (Liu et al., 2000; Sanchez et al., 1999). Ces mécanismes font bien sûr partie de la réponse cellulaire aux lésions de l’ADN mais n’en sont pas le constituant exclusif. L’intégralité des processus mis en œuvre suite à l’activation du checkpoint est loin d’être connue, mais l’on pense que le checkpoint agit par exemple aussi sur les voies de réparation. Cette idée permettrait de donner une explication à l’hypersensibilité aux stress génotoxiques des autres mutants du checkpoint : des voies autres que celles contrôlant la progression dans le cycle seraient affectées chez ces mutants (Liu et al., 2000; Sanchez et al., 1999). Le fait que la délétion de CHK1 ait une incidence sur la déphosphorylation de Rad53 (cf figure n°G10C) suggère que le problème est plus complexe. Même si l’on pense que Chk1 ne sert qu’à consolider l’arrêt en G2/M en cas de dommages, il semble qu’elle soit plus globalement nécessaire au maintien de l’activité du checkpoint. La déphosphorylation précoce de Rad53 observée chez le mutant chk1! ptc2! pourrait résulter du retour des cellules en G1 et ne

pas remettre en cause l’hypothèse concernant le rôle de Chk1 au sein du checkpoint. En effet, Rad53 n’est pas activée en cas de cassure double-brin induite en G1, ce qui suggère que la sortie de mitose après une cassure HO pourrait favoriser l’apparition de conditions dans lesquelles Rad53 ne peut pas être phosphorylée (Ira et al., 2004; Pellicioli et al., 2001). Cependant, le fait que la phosphorylation de Rad53 après une irradiation UV soit identique chez le mutant mec1!

qui est bloqué en G2/M et chez le mutant mec1! mad2! qui est sorti de mitose et repassé en G1

(Clerici et al., 2004), indique que le retour en G1 n’est pas suffisant dans certaines conditions pour inactiver Rad53. Ceci pourrait en partie dépendre du type de stress génotoxique et le cas particulier de la camptothécine n’a pas été étudié.

Malgré le fait que Rad53 et Chk1 semblent régir des voies fonctionnant en parallèle, nos données indiquent que ces dernières ne sont pas complètement déconnectées et pourraient influer l’une sur l’autre. Il serait d’ailleurs intéressant d’étudier la phosphorylation de Chk1 chez le mutant ptc2! ou dans une souche portant le plasmide pGAL-PTC2 (Leroy et al., 2003). Ainsi,

même si le modèle actuel incite à penser que Ptc2 agit directement et uniquement sur Rad53, je pense que la cinétique de phosphorylation de Chk1 suivrait celle de Rad53. Nous avions suggéré en début de discussion que l’inactivation en amont du checkpoint était nécessaire et suffisante pour enclencher les phénomènes d’adaptation et de rétablissement et donc la reprise du cycle. Le fait que la délétion de CHK1 ne joue pas seulement sur la progression du cycle mais aussi sur la cinétique de déphosphorylation de Rad53 reste en accord avec cette hypothèse.

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