Glc7 et l’inactivation des mécanismes de surveillance de l’ADN
3.4. Le mécanisme d’action de Glc7 ?
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visible que dans un contexte de checkpoint « suractivé ». Cela peut être dû, comme nous l’avons souligné, au fait que seule une surexpression modérée a pu être étudiée, la délétion et une forte surexpression de GLC7 étant létales. Mais cela peut aussi être révélateur d’une implication mineure ou indirecte de Glc7 dans les mécanismes de surveillance de l’ADN. Or, Glc7 est impliquée dans de nombreux processus cellulaires. Nous avons donc cherché par le biais de quelle voie connue Glc7 pourrait agir. Deux pistes ont été explorées.
3.4.1. Glc7 et Mad2
Au cours de la mitose, Glc7 antagonise la protéine kinase Ipl1 qui est impliquée dans la régulation de plusieurs processus cellulaires comme la ségrégation des chromatides sœurs et la condensation des chromosomes. Glc7 apparaît comme la phosphatase capable de déphosphoryler les cibles d’Ipl1, et ce couple kinase/phosphatase régule ainsi l’état de phosphorylation de protéines du kinétochore (comme Ndc10) ou de protéines impliquées dans la ségrégation des chromosomes (comme Dam1). Le checkpoint du fuseau bloque certains mutants glc7 en mitose, probablement parce qu’il détecte dans ces mutants des défauts de liaison kinétochores/microtubules.
Nous avons fait l’hypothèse que la surexpression de GLC7 affaiblit le checkpoint du fuseau et que ce dernier est nécessaire dans une certaine mesure à la réponse aux stress génotoxiques. Cependant, aucune donnée expérimentale ne nous permet de penser que la surexpression de GLC7 via le plasmide centromérique a un effet sur le checkpoint du fuseau. Des tests plus précis permettraient peut-être d’obtenir des résultats. Mais l’effet de Glc7 que nous observons chez le mutant ptc2! après cassure HO est du même ordre que celui que nous
observons avec les délétions de MAD1 ou MAD2. Ceci me fait penser qu’un impact de Glc7 sur l’inactivation du checkpoint de l’ADN médié par le checkpoint du fuseau ne serait concevable que si la surexpression de GLC7 influençait de manière significative l’activation du checkpoint du fuseau. Par ailleurs, comme nous l’avons souligné, il n’est pas évident que le checkpoint du fuseau soit activé après induction de la cassure HO. Il reste l’hypothèse, difficile à tester pour le moment, que Glc7 influencerait une fonction de Mad2 indépendante du checkpoint du fuseau qui serait responsable de l’implication de Mad2 dans l’hyperactivation du checkpoint de l’ADN après cassure HO chez les mutants d’adaptation.
L’étude du mutant ipl1-321 pour mimer la surexpression de GLC7 ou des mutants glc7 qui s’arrêtent en mitose de manière dépendante du checkpoint du fuseau (par exemple les mutants glc7-10 et glc7-129) pourrait permettre de compléter cette analyse.
3.4.2. Glc7 et Chk1
L’article de N.R. den Elzen et M.J. O’Connell publié en 2004 montrant l’implication d’une des sous-unités catalytiques de la PP1 chez S. pombe dans la réponse aux stress génotoxiques (den Elzen and O'Connell, 2004) nous a amenés à nous demander si l’effet de Glc7 sur l’inactivation des checkpoints de l’ADN ne résultait pas d’un effet de Glc7 sur Chk1. Ainsi, des éléments indiquant que la PP1c de S. pombe déphosphoryle directement Chk1 nous ont conduits à tester si ce mécanisme pouvait être conservé chez Saccharomyces cerevisiae.
Cependant, aucune interaction physique n’a pu être mise en évidence entre Chk1 et Glc7. De plus, aucune incidence forte de la surexpression de GLC7 sur l’état de phosphorylation de Chk1 n’a été constatée, contrairement à ce qu’il en est chez S. pombe. L’étude de différents mutants glc7 nous permettrait peut-être de savoir si Glc7 est vraiment nécessaire à la
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déphosphorylation de Chk1 au cours des mécanismes d’adaptation et de rétablissement. Nous pourrions aussi peut-être confirmer un impact de la désactivation de Chk1 sur le checkpoint de l’ADN, et notamment sur l’état de phosphorylation de Rad53, en testant l’influence de la délétion de CHK1 sur la létalité induite par l’allèle tetO-RAD53-GFP.
3.4.3. Perspectives pour l’étude de Glc7 dans la régulation du checkpoint de l’ADN
L’hypothèse que Glc7 pourrait exercer ses effets sur l’inactivation du checkpoint de l’ADN ou la sensibilité à la camptothécine en déphosphorylant directement Rad53 demeure plausible. Nous avons tenté de la tester en analysant la sensibilité à la camptothécine de mutants rad53! et ptc2! rad53! surexprimant GLC7. Cependant, les résultats n’étaient pas exploitables
car non reproductibles. Les transformations effectuées pour obtenir ces souches étaient caractérisées par la présence de clones hétérogènes qui montraient de surcroît des phénotypes distincts. Nous ne pourrons obtenir un résultat clair qu’en construisant les souches par croisement. L’étude de la phosphorylation de Rad53 en présence de l’allèle tetO-RAD53-GFP pourrait aussi nous apporter des éléments d’information.
Glc7 pourrait également intervenir en amont du checkpoint et être par exemple nécessaire à la déphosphorylation de Rad9 au cours des processus d’adaptation et de rétablissement. Il a en effet été montré chez les mammifères que PP1" interagit avec et est capable de déphosphoryler Brca1 in vitro (Brca1 est un des homologues putatifs de Rad9 chez les mammifères) et que la surexpression de PP1" inhibe partiellement l’hyperphosphorylation de Brca1 induite par des radiations ionisantes in vivo (Liu et al., 2002). Par ailleurs, chez Schizosaccharomyces pombe, la déphosphorylation de la thréonine 215 de Crb2 est indispensable au rétablissement suite à une irradiation UV, alors que sa phosphorylation n’est pas requise pour l’activation du checkpoint (Esashi and Yanagida, 1999). Or, il a été montré que la phosphorylation de Crb2 induite par une irradiation UV était légèrement atténuée lorsque Dis2 est surexprimée (l’état de phosphorylation de la thréonine 215 n’a toutefois pas été précisément analysé) (den Elzen and O'Connell, 2004). Par ailleurs, des éléments indiquent que Glc7 est impliquée dans l’adaptation suite à l’activation du checkpoint du pachytène en méiose. Notamment, la surexpression de GLC7 semble affaiblir l’arrêt en G2/prophase observé chez les mutants de la recombinaison (Bailis and Roeder, 2000). Or, au cours de ce processus, Glc7 pourrait déphosphoryler Red1, une protéine impliquée dans le checkpoint du pachytène et qui semble jouer le rôle d’adaptateur entre Mec1 et Mek1 (homologue de Rad53). En effet, il a, entre autres, été montré que Glc7 interagissait avec Red1 et qu’elle déphosphorylait Red1 in vitro (Bailis and Roeder, 2000). L’hypothèse selon laquelle Glc7 déphosphorylerait Rad9 au cours des phénomènes d’adaptation et de rétablissement permettrait d’expliquer l’effet de Glc7 sur la cinétique de phosphorylation de Rad53 et la désactivation globale du checkpoint de l’ADN.
Il est possible que l’effet de la surexpression de GLC7 sur la reprise du cycle et la phosphorylation de Rad53 lors d’un traitement à la camptothécine ou d’une cassure HO et l’effet de Glc7 sur la sensibilité à la camptothécine soient le résultat de deux mécanismes distincts. En tout cas, il est clair que le premier n’implique pas le second puisque la délétion de CHK1 ne supprime pas l’hypersensibilité du mutant ptc2! à la camptothécine alors qu’elle accélère la
reprise du cycle chez ce même mutant lors d’un traitement à la camptothécine. Je pense que des tests d’épistasie sur milieu solide contenant de la camptothécine avec des mutants du checkpoint de l’ADN seraient un moyen efficace pour orienter notre étude et mieux comprendre le moyen
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d’action de Glc7 sur l’inactivation de ce mécanisme de surveillance. Ceci devrait être complété par une caractérisation plus exhaustive de l’influence de la surexpression de GLC7 sur la réponse aux dommages de l’ADN. L’étude des interactions entre GLC7 et le mutant cdc13-1 pourrait par exemple permettre de confirmer l’implication de Glc7 dans les processus d’adaptation et de rétablissement et de comparer les effets de Glc7 et Chk1 pour ce stress bien particulier. Par ailleurs, la surexpression de GLC7 restaure la viabilité du mutant ptc2! sur milieu contenant du
4-NQO (données non montrées). L’étude de la progression du cycle après un traitement au 4- NQO serait ainsi intéressante. La recherche d’autres mutants sensibles à la camptothécine et chez lesquels une restauration de la viabilité via la surexpression de GLC7 n’est pas observée pourrait également être informative. La caractérisation de la réponse de différents mutants glc7 aux dommages de l’ADN pourrait également être très instructive. Enfin, nous ne pouvons exclure que la surexpression de GLC7 favorise la sortie de mitose et que la déphosphorylation précoce de Rad53 qu’elle induit chez le mutant ptc2! après une cassure HO soit indirectement due à un
retour des cellules en G1. Nous pourrions utiliser le système Gal-Pds1-mdb (O.Cohen-Fix) pour bloquer le cycle et tester si la déphosphorylation de Rad53 est une simple conséquence de la progression dans le cycle.
L’étude de la régulation de Glc7 en cas de dommages de l’ADN pourrait constituer un autre champ d’investigation. Il a été montré chez S. pombe et chez les mammifères que Dis2 et les isoformes PP1" et PP1# étaient des phosphoprotéines et que leur phosphorylation inhibait leur activité (Guo et al., 2002; Yamano et al., 1994). De plus, une déphosphorylation de PP1" et PP1# dépendante d’ATM a été observée suite à des radiations ionisantes (Guo et al., 2002). Cependant, le site de phosphorylation plus particulièrement mis en cause ne semble pas être présent chez la levure Saccharomyces cerevisiae (Yamano et al., 1994).
Nous avons souligné en introduction le fait que l’existence de nombreuses sous-unités régulatrices pourrait être à l’origine du caractère pléiotrope de la PP1c. Il serait intéressant de savoir quelle(s) sous-unité(s) régulatrice(s) participe(nt) à la fonction de Glc7 dans l’inactivation des checkpoints de l’ADN. Plusieurs sous-unités déjà connues sont intéressantes, parce qu’elles régulent l’activité de Glc7 au cours de la mitose ou au cours de l’adaptation en méiose :
• GLC8 : Glc8 est comme Glc7 nécessaire à une accumulation normale de glycogène et est un inhibiteur de Glc7 in vitro (Tung et al., 1995). Le fait que GLC8 montre des interactions génétiques avec le mutant ipl1-1 est intéressant : la délétion et la surexpression de GLC8 suppriment le défaut de croissance de ce mutant à température restrictive (Tung et al., 1995) suggérant un ou plusieurs rôle(s) de Glc8 au cours de la mitose.
• SDS22 : la surexpression de SDS22 supprime la thermosensibilité et l’accumulation en G2/M à température restrictive du mutant glc7-12 (MacKelvie et al., 1995). L’étude d’allèles thermosensibles de SDS22 suggère une contribution de Sds22 aux fonctions mitotiques de Glc7. Les mutants sds22 thermosensibles montrent un fort taux de perte de chromosomes. Ces mutations sds22, tout comme les mutations glc7-127 et glc7-129, suppriment partiellement le caractère thermosensible du mutant ipl1-2 (Hsu et al., 2000; Peggie et al., 2002). La surexpression de GLC7 supprime partiellement la thermosensibilité de ces mutants sds22 (Peggie et al., 2002). De plus, ces mutants sds22 montrent une localisation
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de Glc7 sous forme de foci intenses mais pas forcément situés dans le noyau à température restrictive, contrairement à la localisation diffuse nucléaire observée chez la souche sauvage (Peggie et al., 2002). La surexpression de SDS22 restaure aussi la viabilité du mutant ipl1-321 à température restrictive (Pinsky et al., 2006). Sds22 pourrait affecter l’activité, la localisation, voire être une chaperone de Glc7. • BUD14 : Bud14 semble être responsable du recrutement de Glc7 au niveau du
cortex du bourgeon où la phosphatase pourrait réguler les interactions microtubules/cortex nécessaires au positionnement du fuseau en mitose (Knaus et al., 2005). Il a par ailleurs été montré que la surexpression de BUD14 supprimait la thermosensibilité du mutant ipl1-321, ce qui pourrait suggérer que Bud14 est également impliquée dans la régulation des interactions kinétochores/microtubules (Pinsky et al., 2006).
• FPR3 : la délétion de FPR3 et la surexpression de GLC7, affaiblissent l’arrêt dépendant du checkpoint du pachytène observé chez les mutants de la recombinaison, et ne montrent pas d’effet additif. La surexpression de FPR3 exacerbe l’arrêt de ces mutants et supprime l’effet de la surexpression de GLC7. Ainsi, Fpr3 semble permettre le maintien du checkpoint du pachytène, probablement en inhibant Glc7 (Hochwagen et al., 2005). Il serait intéressant de tester si Fpr3 a un rôle analogue dans le checkpoint de l’ADN en mitose.
J’ai testé la sensibilité à la camptothécine de plusieurs souches délétées pour des sous- unités régulatrices connues de Glc7. Parmi les délétants bud14!, gac1!, gip1!, gip2!, gip3!,
gip4!, glc8!, pig1!, pig2!, red1!, reg1!, reg2!, shp1! issus de la banque EUROSCARF, seul
le mutant bud14! exhibe une hypersensibilité à la camptothécine et au 4-NQO sans montrer un
défaut de croissance majeur en absence de stress génotoxique. Il est intéressant de noter qu’une interaction physique a été détectée entre Bud14 et Rad53 (Smolka et al., 2006). Cependant, la surexpression de GLC7 n’a aucune influence sur l’hypersensibilité des cellules bud14! à la
camptothécine et le mutant bud14! ne montre pas de défaut d’adaptation après cassure HO
(données non montrées). Par ailleurs, l’interaction entre Bud14 et Rad53 pourrait être liée aux rôles de ces protéines dans la croissance polarisée (Cullen and Sprague, 2002; Smolka et al., 2006).
Résultats et Discussion – Checkpoints de l’ADN et checkpoint du fuseau