Inhibition de Cdc

Les données exposées ci-dessus suggèrent que les mutants mad2! et pds1! doivent

présenter des phénotypes identiques en cas de dommages du fuseau. Cependant, il a été montré que la cycline Clb3, qui est stabilisée après un traitement au nocodazole, est dégradée chez le mutant mad2! mais pas chez le mutant pds1! (Alexandru et al., 1999). En fait, la voie Mad2

n’inhibe pas seulement la dégradation de Pds1. Elle semble plus précisément être responsable d’une inhibition directe du complexe APC/Cdc20, comme nous l’exposons ci-après. Or, ce complexe est responsable de la dégradation de Pds1, mais aussi de celle de Clb3 et Clb5 et sûrement de celle d’autres protéines en mitose. L’impact de la stabilisation des protéines autres que Pds1 ciblées par APC/Cdc20 sur l’arrêt mis en place par le checkpoint du fuseau n’est pas évident et n’a pas été beaucoup étudié.

Des données permettent aujourd’hui de proposer un mécanisme moléculaire expliquant

Les deux voies du checkpoint du fuseau et leurs liens avec les blocages de l’anaphase et de la sortie de mitose. D’après (Alexandru et al., 1999).

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l’inhibition de la transition métaphase/anaphase par le checkpoint du fuseau. Cette inhibition semble nécessiter une interaction directe entre des protéines du checkpoint du fuseau et la protéine Cdc20, interaction qui inactiverait le complexe APC/Cdc20. Par contre, le mécanisme moléculaire permettant au checkpoint du fuseau d’inhiber la sortie de mitose n’est pas élucidé.

3.4.1.1. Mad2 et Cdc20

Si l’on relargue des cellules HeLa dans un milieu sans drogue après les avoir traitées au nocodazole, l’activité du complexe APC purifié augmente progressivement comme on peut en juger par l’ubiquitinylation in vitro de la cycline B1 de xénope (Fang et al., 1998). Ceci suggère que l’activité de l’APC pourrait être inhibée lorsque le checkpoint du fuseau est activé. Ceci semble être confirmé par le fait que le complexe APC purifié à partir d’extraits d’œufs de xénope montre une activité plus faible in vitro envers la cycline B1 si l’on a préalablement ajouté de la protéine hMad2 recombinante à l’extrait (Fang et al., 1998). Cette donnée montre également que la protéine Mad2 pourrait jouer un rôle dans l’inhibition de l’APC. D’ailleurs, l’ajout de hMad2 dans des extraits d’œufs de xénope empêche l’ubiquitinylation des cyclines B et leur protéolyse (Fang et al., 1998; Li et al., 1997). Une interaction entre hMad2, préalablement ajoutée à des extraits d’œufs de xénope arrêtés en mitose, et les sous-unités Cdc16 et Cdc27 de l’APC de xénope a été mise en évidence (Li et al., 1997). De plus, une interaction plus physiologique entre Mad2 et les sous-unités Cdc16 et Cdc27 de l’APC dans des cellules HeLa traitées au nocodazole a été détectée (Li et al., 1997). C’est pourquoi il a été proposé en premier lieu que la protéine Mad2 inhibe directement le complexe APC (Li et al., 1997).

Cependant, des données suggèrent que l’interaction entre Mad2 et l’APC pourrait se faire par l’intermédiaire de Cdc20, une sous-unité régulatrice de l’APC, qui a pu être co-purifiée dans les expériences précédentes (cf figure n°I18). En effet, une interaction entre Cdc20 et Mad2 a été mise en évidence chez Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, mais également chez les cellules humaines (Fang et al., 1998; Hwang et al., 1998; Kim et al., 1998). Chez Saccharomyces cerevisiae, les auteurs soulignent d’ailleurs qu’ils n’ont pas réussi à observer une interaction directe entre l’APC et Mad2 (Hwang et al., 1998). L’ensemble des résultats obtenus peuvent être concordants puisque l’existence d’un complexe ternaire Mad2-Cdc20-APC in vivo a été proposée chez l’homme. Des interactions deux à deux ont en effet été mises en évidence chez des cellules HeLa traitées au nocodazole et il a été observé que Mad2 n’interagissait pas avec l’APC in vitro en absence de Cdc20 (Fang et al., 1998). L’hypothèse que Mad2 soit capable d’inhiber l’APC par l’intermédiaire de Cdc20 est confortée par le fait que la préincubation de hCdc20 avec hMad2 inhibe complètement la capacité de hCdc20 à activer l’APC purifié à partir d’œufs de xénope en interphase in vitro (Fang et al., 1998).

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Figure n°I18

Des données obtenues chez la levure bourgeonnante et la levure fissipare suggèrent que Cdc20 est bien une cible du checkpoint du fuseau in vivo et que l’interaction Cdc20/Mad2 est nécessaire à l’inhibition du complexe APC et au blocage du cycle en cas de dommages du fuseau. En effet, chez Saccharomyces cerevisiae, la surexpression de CDC20 permet aux cellules de rebourgeonner en présence de nocodazole de façon dépendante de l’APC et de dégrader à terme Clb2 (Hwang et al., 1998; Tinker-Kulberg and Morgan, 1999). La surexpression de CDC20 permet également de supprimer l’arrêt induit par le nocodazole dans les cellules HeLa (Tang et al., 2001). Chez S. cerevisiae, des mutants cdc20 défectueux pour l’interaction avec Mad2 mais qui ne sont pas affectés pour les fonctions essentielles de Cdc20 ont été identifiés. L’expression de ces mutants supprime l’arrêt des cellules surexprimant MPS1 et leur permet de proliférer. Elle permet également à des cellules traitées au nocodazole de rebourgeonner (Hwang et al., 1998). Par ailleurs, il a été montré par FACS, que l’un de ces mutants montre le même retard dans la cinétique de reréplication que le mutant mad2! en cas de traitement au nocodazole alors que le

double mutant cdc20 bub2! se comporte comme le mutant bub2! mad2! (Alexandru et al.,

1999). La dégradation de Clb2 observée chez le double mutant pds1! bub2! (Alexandru et al.,

1999) semble confirmer que ce n’est pas le complexe APC qui est inhibé mais le complexe APC/Cdc20 chez S. cerevisiae. Chez S. pombe, un mutant slp1 (slp1+ est l’homologue chez la levure fissipare de CDC20), défectueux pour l’interaction avec Mad2 mais ne présentant pas de défaut lors d’un cycle normal, est sensible au thiabendazole comme le mutant mad2! (Kim et al.,

Mad2 inhibe la dégradation de Pds1 et l’initiation de l’anaphase.

À la transition métaphase/anaphase, la sécurine Pds1 est ubiquitinylée par le complexe APC/Cdc20 et dirigée vers le protéasome. La dégradation de Pds1 active la séparase Esp1 qui est inhibée par son interaction avec Pds1. Esp1 clive la cohésine, qui maintient les chromatides sœurs attachées. Ceci permet la ségrégation des chromatides sœurs vers les pôles du fuseau.

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1998). De plus, ce mutant supprime l’arrêt en métaphase du mutant cut7 (mutant défectueux pour l’assemblage du fuseau) et le double mutant slp1 cut7 présente une accumulation de cellules à 4C d’ADN, de manière identique à ce que l’on observe chez le double mutant cut7 mad2! (Kim et

al., 1998). Par ailleurs, la croissance des mutants cut4 et cut9 (cut4+ et cut9+ codent pour deux sous-unités de l’APC) est affectée par la surexpression de mad2+ contrairement à celle des doubles mutants cut4 slp1 et cut9 slp1 (Kim et al., 1998).

Des données contradictoires ont été obtenues concernant la régulation de l’interaction Cdc20/Mad2. En effet, chez Saccharomyces cerevisiae, l’interaction Mad2/Cdc20 semble être constitutive. Le signal montrant l’interaction est moins fort pour des cellules asynchrones ou en phase G1, mais le taux de Cdc20 est également plus faible dans ces conditions (Hwang et al., 1998). Par contre, dans les cellules HeLa, l’interaction entre Mad2 et Cdc20 semble être plus faible en G1/S que lors d’un blocage en mitose induit par un traitement au nocodazole (Tang et al., 2001). De plus, dans les cellules HeLa, Mad2 semble se dissocier du complexe APC/Cdc20 après le relargage d’un blocage au nocodazole (Fang et al., 1998; Li et al., 1997). Cdc20 se dissocie un peu plus tard du complexe APC et ce dernier se lie alors à Cdh1 (Fang et al., 1998). Le modèle suivant a été proposé : l’association Mad2/Cdc20/APC n’a lieu qu’en mitose et le blocage dû au checkpoint du fuseau dure tant que Mad2 reste associé au complexe APC/Cdc20 ; l’APC est ensuite activé par sa liaison avec Cdc20 lorsque le checkpoint est désactivé ; puis la liaison d’APC avec Cdh1 va permettre une activation plus tardive du complexe et conduire à la dégradation des cyclines B et contribuer à la sortie de mitose (Fang et al., 1998). Les différentes données obtenues concernant la régulation de l’interaction Cdc20/Mad2 pourraient refléter des spécificités de chaque organisme. Cependant, il est possible que l’affinité de Mad2 pour Cdc20 soit aussi moins forte en interphase chez la levure mais que ceci soit difficile à mettre en évidence à cause du plus faible taux de Cdc20 pendant cette phase du cycle.

L’étude de Fang et al., 1998 montre que hMad2 exprimé chez E. coli existe sous forme de monomères et tétramères, mais que seule la forme tétramérique est capable d’inhiber le complexe APC. Ceci pourrait refléter le fait que la protéine Mad2 doive subir un changement conformationnel pour pouvoir jouer un rôle inhibiteur. Nous ne savons pas à ce jour pourquoi la liaison de Mad2 avec Cdc20 bloque biochimiquement l’activité du complexe APC.

3.4.1.2. BubR1 et Cdc20

Mad2 ne semble pas être la seule protéine du checkpoint du fuseau capable d’inhiber le complexe APC/Cdc20. En effet, il a été montré que BubR1 interagissait physiquement avec Cdc20 en co-immunoprécipitation dans les cellules HeLa (Fang, 2002; Tang et al., 2001). Comme l’interaction Mad2/Cdc20, l’interaction entre BubR1 et Cdc20 dans les cellules HeLa semble être plus forte en mitose qu’en interphase, cela en présence ou en absence de nocodazole, et cette interaction disparaît lors du relargage des cellules après un blocage au nocodazole (Fang, 2002; Tang et al., 2001). Par ailleurs, nous avons vu dans le paragraphe précédent que la présence de hCdc20 augmentait fortement l’activité in vitro du complexe APC purifié à partir d’extraits d’œufs de xénope en interphase et que la préincubation de hCdc20 avec hMad2 (sous forme d’oligomères) supprimait cet effet (Fang et al., 1998). Il en est de même si la protéine hMad2 est ajoutée de façon concomitante à hCdc20 (Tang et al., 2001). Il a été montré, dans ces conditions, que hBubR1 inhibait également l’activation de l’APC par hCdc20, contrairement à hBub1 et hBub3. Cet effet est spécifique de Cdc20 puisqu’on ne l’observe pas pour le complexe APC/Cdh1 (Tang et al., 2001). BubR1 paraît d’ailleurs être un inhibiteur plus efficace puisque

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l’on observe une même inhibition du complexe APC/Cdc20 à des concentrations de BubR1 inférieures à celles de hMad2 in vitro (Fang, 2002; Tang et al., 2001). Il a ainsi été supposé, connaissant les concentrations physiologiques de Mad2 et BubR1, que BubR1 pourrait inhiber seul APC/Cdc20 in vivo alors qu’il est peu probable que Mad2 se lie directement à Cdc20 dans la cellule sans l’intervention d’autres protéines (Tang et al., 2001).

BubR1 et Mad2 montrent des effets synergiques concernant l’inhibition d’APC/Cdc20 in vitro (Fang, 2002; Tang et al., 2001). En effet, l’addition concomitante de BubR1 et de Mad2 à des concentrations où ces protéines n’inhibent pas l’activation de l’APC par Cdc20 lorsqu’elles sont présentes seules, permet de retrouver une inhibition maximale d’APC/Cdc20 (Fang, 2002). Par ailleurs, Mad2 semble promouvoir l’interaction entre BubR1 et Cdc20 et inversement (Fang, 2002). La protéine BubR1 semble être importante pour comprendre le mécanisme d’action du checkpoint du fuseau puisqu’elle est un meilleur inhibiteur in vitro d’APC/Cdc20 que Mad2. Le fait que la surexpression de BUBR1 permette de restaurer l’arrêt des cellules HeLa traitées au nocodazole et surexprimant CDC20, suggère que BubR1 est également un inhibiteur in vivo de Cdc20 (Tang et al., 2001).

Le complexe APC semble devoir être modifié pour pouvoir subir l’influence du checkpoint du fuseau. En effet, BubR1 est capable d’inhiber le complexe APC/Cdc20 si le complexe APC a été purifié à partir de cellules HeLa en phase S, G2 ou en début de mitose, mais pas si la purification a été faite à partir de cellules en fin de mitose ou en phase G1 (Tang et al., 2001). De même, BubR1 bloque efficacement l’activité du complexe APC/Cdc20, si l’APC a été purifié à partir d’extraits d’œufs de xénope en interphase et pas en mitose (Tang et al., 2001).

Chez la levure, Mad3 pourrait également être un inhibiteur de l’APC/Cdc20. En effet, Mad3 interagit avec Cdc20 via une des deux régions de similarité qu’elle possède avec Bub1 (Hardwick et al., 2000; Hwang et al., 1998). Par ailleurs, un mutant mad3 défectueux pour cette interaction est aussi sensible au bénomyle que le délétant mad3!, ce qui suggère que cette liaison

est critique pour le bon fonctionnement du checkpoint (Hardwick et al., 2000).