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Glc7 et l’inactivation des mécanismes de surveillance de l’ADN

2.9. Glc7 et Mad

2.9.1. Influence de la délétion de MAD2 sur la réponse aux stress génotoxiques

2.9.1.1. Influence de la délétion de MAD2 sur l’adaptation après cassure HO

L’arrêt en G2/M après irradiation UV dans un mutant mec1! et l’arrêt résiduel en G2/M

après un traitement au MMS dans un mutant rad9! rad24! sont dépendants de MAD2 puisqu’ils

sont affaiblis si ce gène est délété (Clerici et al., 2004; Garber and Rine, 2002). Pour mettre en évidence une implication éventuelle du checkpoint du fuseau dans la réponse à une coupure double-brin, nous avons testé l’effet de la délétion de MAD2 sur l’adaptation après une cassure HO. Nous avons commencé par analyser le comportement de mutants d’adaptation, à savoir les mutants ptc2!, yku80!, tid1! et ckb1!. Comme on peut le voir sur la figure n°G15A,

l’invalidation de MAD2 améliore l’adaptation de ces souches puisqu’elle entraîne une réduction significative du nombre de cellules restées bloquées en G2/M. Pour vérifier que cet effet est bien dû au checkpoint du fuseau et qu’il n’est pas spécifique de MAD2, l’expérience a été reconduite

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avec une délétion de MAD1. Celle-ci supprime le défaut d’adaptation du mutant ptc2! de

manière identique à la délétion de MAD2. Les profils des doubles mutants ptc2! mad2! et ptc2!

mad1! sont en effet très similaires (cf figure n°G15A). Les simples délétants mad1! et mad2!

ont aussi des profils d’adaptation comparables, proches de celui de la souche sauvage (cf figure n°G15B). Une faible amélioration de l’adaptation induite par la délétion de MAD1 ou de MAD2 dans la souche sauvage a toutefois souvent été constatée. Les phénotypes obtenus après délétion de MAD1 ou MAD2 sont très semblables à ceux obtenus avec une surexpression modérée de GLC7. On observe dans les deux cas un faible effet sur la souche sauvage et une amélioration conséquente du phénotype des mutants d’adaptation. Afin de savoir si ces deux effets sont cumulatifs, nous avons établi le profil d’adaptation d’une souche ptc2! mad2! portant le

plasmide pRS314/GLC7 (cf figure n°G15C). La capacité d’adaptation de cette souche est similaire à celle obtenue après la disruption de MAD2 ou la surexpression de GLC7 seule. Un test analogue semble indiquer qu’il n’y a pas non plus d’effet cumulatif de la surexpression de GLC7 et de la délétion de MAD2 dans un contexte sauvage (données non montrées). Ces données ne sont pas contradictoires avec l’idée d’un effet indirect de Glc7 sur l’adaptation via le checkpoint du fuseau. Toutefois, les interprétations de ces deux derniers tests sont à prendre avec précaution comme nous l’avions déjà souligné lors de l’étude des mutants chk1!.

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Pour compléter notre étude sur l’adaptation, nous avons, comme précédemment, suivi la cinétique de phosphorylation de Rad53, ainsi que la progression dans le cycle après cassure HO de souches invalidées pour les gènes MAD1 ou MAD2 (cf figure n°G16). Les résultats obtenus sont en accord avec les données des tests d’adaptation. Les protéines Mad1 et Mad2 n’apparaissent pas nécessaires à l’activation du checkpoint de l’ADN suite à une cassure double- brin. En effet, les mutants mad1! et mad2! s’arrêtent en G2/M avec une cinétique similaire à

celle de la souche sauvage et sont synchronisés en G2/M 6 heures après l’induction de la coupure (cf figure n°G16C). De plus, Rad53 est phosphorylée dans les mêmes délais et avec la même intensité chez les mutants mad1! et mad2! et dans la souche sauvage (cf figure n°G16A). La

délétion des protéines du checkpoint du fuseau n’a pas non plus d’influence sur l’activation du checkpoint de l’ADN dans un mutant ptc2! (cf figures n°G16A et G16C) mais accélère

significativement la déphosphorylation de Rad53 et la reprise du cycle : aux temps t=12h, 15h et 18h, les formes phosphorylées de Rad53 sont prépondérantes chez le mutant ptc2! alors qu’elles

sont minoritaires chez les doubles délétants ptc2! mad2! et ptc2! mad1!, et une proportion

significative de cellules ptc2! mad1! et ptc2! mad2! sortent de mitose et retournent en phase

G1, comme l’indiquent les profils de FACS aux mêmes temps (cf figures n°G16A et G16C). Ce résultat n’est pas spécifique du mutant ptc2!, puisque la disruption de MAD2 accélère la

déphosphorylation de Rad53 (cf temps t=12h et 15h sur la figure n°G16B) chez un autre mutant d’adaptation, le mutant tid1!. Les délétions de MAD1 ou de MAD2 n’ont par contre pas

d’influence sur la déphosphorylation de Rad53 et la reprise du cycle chez la souche sauvage, ce qui est en accord avec les données obtenues pour les tests d’adaptation (cf figures n°G16A et

Influence de la délétion de MAD2 sur l’adaptation après cassure HO.

A. Test d’adaptation effectué sur les souches MCM413 (JKM139 ptc2!), L275 (JKM139 ptc2!

mad2!), L279 (JKM139 ptc2! mad1!), MCM694 (JKM139 bar1! yku80!), L31 (JKM139 bar1! yku80! mad2!), MCM347 (JKM179 tid1!), L34 (JKM179 tid1! mad2!), MCM449 (JKM139 ckb1!) et L36 (JKM139 ckb1! mad2!).

B. Test d’adaptation effectué sur les souches MCM336 (WT, JKM139), L25 (JKM139 mad2!) et L20 (JKM139 mad1!).

C. Test d’adaptation effectué sur les souches MCM413 (JKM139 ptc2!) et L275 (JKM139 ptc2!

Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN G16C). Figure n°G16 18h 15 12 9 6 4 2 0 ptc2 ! mad2 ! + pRS316 mad1 ! + pRS316 W T + pRS316 ptc2! mad1 ! ptc2 ! mad2 !

C

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Il avait été montré chez Saccharomyces cerevisiae que les protéines du checkpoint du fuseau était impliquées dans l’arrêt résiduel induit par un stress génotoxique dans des souches déficientes pour les checkpoints de l’ADN (Clerici et al., 2004; Garber and Rine, 2002). Nous montrons ici que le maintien d’un checkpoint de l’ADN suractivé dépend aussi de ces protéines.

Nous avons voulu savoir si la présence de la cassure HO activait le checkpoint du fuseau. Pour cela, nous avons analysé l’état de phosphorylation de Mad1. Mad1 est en effet légèrement phosphorylée en G2/M au cours d’un cycle normal, et est hyperphosphorylée lorsque le checkpoint du fuseau est activé. Six heures après l’induction de la coupure HO, Mad1 ne montre en Western-Blot qu’une phosphorylation comparable à celle observée en G2/M au cours d’un cycle non perturbé, alors que des bandes correspondant aux formes hyperphosphorylées de Mad1 induites par un traitement au nocodazole sont observables avec nos conditions de migration (cf figures n°G17A et G17B). Mad1 n’est pas non plus hyperphosphorylée aux temps t=9h, 12h et 15h après cassure HO (données non montrées).

Figure n°G17

Influence de la délétion de MAD2 sur l’état de phosphorylation de Rad53 et la reprise du cycle après cassure HO.

A. Les souches MCM336 (WT, JKM139), L26 (JKM139 mad2!), L21 (JKM139 mad1!) , MCM413 (JKM139 ptc2!), L276 (JKM139 ptc2! mad2!) et L280 (JKM139 ptc2! mad1!) portant ou non le plasmide vide pRS316 sont cultivées en raffinose. On induit l’expression de HO en ajoutant du galactose à t=0. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après induction et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre la protéine Rad53.

B. Les souches MCM347 (JKM179 tid1!) et L34 (JKM179 tid1! mad2!) sont cultivées en milieu liquide contenant du raffinose. On induit l’expression de HO en ajoutant du galactose à t=0. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après induction et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre la protéine Rad53.

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Par ailleurs, nous avons testé l’influence de l’activation du checkpoint du fuseau sur la réponse d’une souche sauvage à une coupure HO en ajoutant du nocodazole dans le milieu de culture en même temps que le galactose (qui induit l’expression de HO). La figure n°G17C montre que le nocodazole n’a aucune influence sur la cinétique de phosphorylation de Rad53 après cassure HO. De plus, le profil d’adaptation de la souche sauvage n’est pas modifié en présence de nocodazole (données non montrées). Peut-être aurait-il fallu refaire l’expérience en ajoutant du nocodazole quelques heures après induction de la cassure pour éliminer les hypothèses d’une dégradation éventuelle de la drogue ou d’une adaptation des cellules à cette drogue. Comme il a été précisé en introduction, la surexpression de MPS1 est considérée comme un moyen artificiel d’activation du checkpoint du fuseau. Nous avons par ailleurs vu que le mutant ipl1-321 était défectueux pour le maintien de l’arrêt induit par la surexpression de MPS1 alors qu’il ne l’est pas pour l’arrêt induit par un traitement au nocodazole (Biggins and Murray, 2001) et que Glc7 semble antagoniser les fonctions mitotiques de la kinase Ipl1. Comme la surexpression de GLC7 accélère la désactivation d’un checkpoint de l’ADN suractivé, on pouvait s’attendre à ce que la surexpression de MPS1 retarde l’inactivation du checkpoint de l’ADN. Cependant, comme l’indique la figure n°G17D, la surexpression de MPS1 ne modifie pas la cinétique de déphosphorylation de Rad53.

Checkpoint du fuseau et checkpoint de l’ADN.

A. (partie haute) Les souches L59 (JKM139 MAD1-myc) et L62 (JKM139 HO inc MAD1-myc) sont cultivées en milieu liquide contenant du raffinose. On induit l’expression de HO en ajoutant du galactose, et on ajoute ou non du nocodazole dans le milieu de culture à t=0. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après induction et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre le tag Myc. La souche L62 a un site HO incoupable (HO inc), l’ajout de galactose n’engendre donc pas la formation d’une cassure double-brin dans cette souche. (partie basse) Une culture en phase exponentielle de la souche L62 (JKM139 HO inc MAD1-myc) est synchronisée en G1 avec de l’"-facteur, lavée deux fois et relarguée dans un milieu contenant du galactose. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après relargage et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre le tag Myc.

B. Analyse par FACS des points de la figure n°A.

C. La souche MCM336 (JKM139) est cultivée en milieu liquide contenant du raffinose. On induit l’expression de HO en ajoutant du galactose et on ajoute ou non du nocodazole dans le milieu de culture à t=0. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après induction et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre la protéine Rad53.

D. La souche MCM336 (JKM139) portant le plasmide vide p415GAL1 ou le plasmide p415GAL1/MPS1 est cultivée en milieu liquide contenant du raffinose. On induit l’expression de

HO en ajoutant du galactose à t=0. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après induction et

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Les relations entre checkpoint du fuseau et checkpoint de l’ADN ne sont donc pas claires. L’idée simple selon laquelle l’activation du checkpoint du fuseau renforcerait l’arrêt en G2/M après un stress génotoxique et que son inactivation accélèrerait la reprise du cycle après des lésions de l’ADN n’est pas confirmée. On peut toutefois imaginer que la cellule a sélectionné des mécanismes empêchant de « cumuler » les arrêts en G2/M engendrés par l’activation des deux checkpoints.

2.9.1.2. Influence de la délétion de MAD2 sur la réponse à la

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