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Glc7 et l’inactivation des mécanismes de surveillance de l’ADN

1.1. Les moyens d’étude de l’adaptation

Une souche spécifique a été construite par le laboratoire de James Haber pour étudier le phénomène d’adaptation : la souche JKM139. Cette souche a été modifiée de manière à pouvoir permettre l’induction d’une cassure double-brin unique et irréparable par ajout de galactose dans le milieu de culture. La cassure est générée par une endonucléase naturelle, l’endonucléase HO. Trois sites de restriction pour cette endonucléase sont naturellement présents dans une cellule haploïde de levure Saccharomyces cerevisiae. Ils sont situés sur le chromosome III. Un de ces sites est situé au locus MAT (locus conférant le type sexuel (a ou ")). Les deux autres sites sont situés aux loci HML" et HMRa, mais l’organisation de la structure chromatinienne rend ces deux

derniers inaccessibles à l’enzyme. Lors du changement de type sexuel, l’ADN est clivé au niveau du seul site HO accessible et la cassure est réparée par recombinaison homologue en utilisant l’une des cassettes homologues HML" et HMRa. Dans la souche JKM139, le gène codant pour

l’endonucléase HO a été délété. Une construction ‘promoteur GAL’-HO, plaçant l’expression de l’endonucléase sous le contrôle du promoteur GAL inductible par le galactose, a été insérée au locus ADE3. On a ainsi une expression contrôlée de l’endonucléase. Par ailleurs, les cassettes HML et HMR ont été délétées pour empêcher la réparation de la cassure double-brin par recombinaison homologue (cf figure n°G1).

Ainsi, la souche JKM139 est cultivée la nuit dans un milieu contenant du raffinose. L’expression de HO n’est alors ni réprimée (comme elle le serait en présence de glucose), ni induite. L’ajout de galactose dans le milieu entraîne l’expression du gène HO et une induction rapide d’une coupure unique et irréparable au locus MAT. En fait, il existe une compétition entre NHEJ et recombinaison homologue pour la réparation de cette cassure. Le NHEJ peut réparer efficacement les extrémités intactes générées par l’endonucléase. Si le NHEJ répare de manière fidèle, l’endonucléase coupe à nouveau le site HO. Plusieurs cycles de réparation par NHEJ peuvent avoir lieu, mais dès que les extrémités de la cassure sont résectées, le NHEJ ne peut plus agir et le processus de recombinaison homologue est irréversiblement engagé (Frank-Vaillant and Marcand, 2002). Comme la réparation par recombinaison homologue n’est pas possible, la cassure devient irréparable. Le NHEJ peut parfois réparer de façon mutagène et altérer le site HO, ce qui entraîne la formation de colonies viables. Cependant, seule une cellule sur 1000 semble être concernée par ce phénomène (Lee et al., 1998).

Il a été montré que l’induction d’une seule cassure double-brin est suffisante pour activer le checkpoint de l’ADN (Sandell and Zakian, 1993). Ainsi, 6 heures après ajout de galactose, on observe une accumulation des cellules en G2/M par FACS : les cellules sont arrêtées dans le cycle par le checkpoint. On peut suivre le devenir de ces cellules individuellement en les « spottant » sur galactose puis en les observant au microscope. On constate alors qu’une grande majorité des cellules ne restent pas arrêtées indéfiniment en G2/M mais qu’elles arrivent au contraire à effectuer quelques divisions. Lors de ces divisions, malgré le fait que la lésion soit toujours présente, les cellules ne subissent plus d’arrêt du cycle. C’est pourquoi, on qualifie le phénomène d’adaptation, puisque les cellules ne réagissent plus à un stimulus auquel elles étaient

Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN sensibles.

Figure n°G1

La souche JKM139 et l’étude de l’adaptation.

A. Les modifications du chromosome III dans la souche JKM139: délétion de HML et HMR.

B. Après ajout de galactose dans le milieu de culture, une cassure double-brin unique et irréparable est induite au site HO. Cette cassure déclenche l’activation du checkpoint de l’ADN qui arrête les cellules en G2/M. On peut suivre la capacité d’adaptation des souches par observation au microscope 24 heures après induction de la coupure: la souche sauvage reprend le cycle et forme des microcolonies, les mutants d’adaptation restent bloqués en G2/M. Photographies extraites de (Lee et al., 1998).

Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN

Pour quantifier la capacité d’adaptation d’une souche, le laboratoire de James Haber a mis au point un test nommé « test d’adaptation ». Il consiste à cultiver la souche dans un milieu liquide contenant du raffinose comme seule source de carbone, puis à induire la cassure par ajout de galactose. Les cellules se synchronisent en G2/M en quelques heures via l’activation de leur checkpoint. On dépose alors des gouttes de suspensions cellulaires sur un milieu contenant du galactose (« spotting »). Le lendemain, chaque cellule isolée a évolué sous la forme d’une microcolonie comportant de deux (pour les cellules qui sont restées bloquées en G2/M) à une vingtaine de cellules environ (cf figure n°G1). Par un comptage sur 200 microcolonies environ, on détermine le pourcentage de microcolonies comportant 2 cellules, comportant 3 cellules, 4 cellules, etc… Ainsi, la capacité d’adaptation d’une souche (c’est-à-dire sa capacité à inactiver le checkpoint de l’ADN et à reprendre son cycle de division après le blocage en G2/M) est évaluée par sa capacité à former des microcolonies comportant un nombre de cellules d’autant plus important que la souche adapte mieux. Pour la souche sauvage, on obtient typiquement un maximum de microcolonies à 3, 4 ou 5 cellules. Moins de 10% des cellules restent bloquées en G2/M et moins de 10% arrivent à former des microcolonies de 8 cellules et plus. Un comptage représentatif pour la souche sauvage est montré figure n°G6A.

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