Blocage de la transition métaphase/anaphase

Pour étudier l’influence d’un blocage des cellules à la transition métaphase/anaphase indépendamment de l’activation du checkpoint du fuseau, j’ai utilisé le vecteur pGAL-PDS1-mdb qui permet de surexprimer une forme non dégradable de Pds1. J’ai synchronisé les cellules d’une souche sauvage et d’une souche mad2! portant ou non le plasmide pGAL-PDS1-mdb à l’"-

facteur en raffinose avant de les relarguer en présence ou en absence de nocodazole dans un milieu contenant du galactose. Une fois que les cellules ont atteint la phase G2/M, elles sont irradiées aux UV puis elles sont incubées à nouveau dans un milieu contenant du galactose en présence ou en absence de nocodazole comme précédemment. Cependant, comme le montre la figure n°M10, le résultat est loin d’être clair. Il est difficile d’interpréter l’expérience, parce que le fait que la phosphorylation de Rad53 soit maintenue dans les contrôles sans le vecteur pGAL- PDS1-mdb est déjà difficile à dire. En effet, pour les souches sauvages et mad2! portant le

vecteur vide et non traitées au nocodazole, Rad53 reste phosphorylée jusqu’à la fin de l’expérience ce qui est en accord avec les résultats déjà obtenus. Par contre, dans la souche mad2! portant le plasmide vide et traité au nocodazole, la phosphorylation de Rad53 ne semble

Influence de différents points d’arrêt du cycle sur la réponse aux UV.

A. La souche sauvage L228 (DLY) est synchronisée à l’"-facteur à 23°C. Elle est ensuite relarguée dans un milieu frais à 37°C pendant 1h30. On lui fait alors subir une irradiation UV (40J/m2) à t=0. Elle reste par la suite incubée à 37°C. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après irradiation et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre la protéine Rad53.

B. La souche sauvage L228 (DLY) est synchronisée à l’"-facteur à 23°C. Elle est ensuite relarguée dans un milieu frais contenant du nocodazole (15 µg/ml) à 37°C pendant 1h30. On lui fait alors subir une irradiation UV (40J/m2) à t=0. Elle reste par la suite incubée à 37°C en présence de nocodazole. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après irradiation et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre la protéine Rad53.

C. La souche L226 (DLY cdc15-2) est synchronisée à l’"-facteur à 23°C. Elle est ensuite relarguée à 37°C pendant 2h30. On lui fait alors subir une irradiation UV (40J/m2_{) à t=0. Elle reste par la suite}

incubée à 37°C. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après irradiation et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre la protéine Rad53.

D. Analyse par FACS des points de la figure n°A. E. Analyse par FACS des points de la figure n°B. F. Analyse par FACS des points de la figure n°C.

Résultats et Discussion – Checkpoints de l’ADN et checkpoint du fuseau

pas être maintenue (cf figure n°M10). On ne peut donc tirer des conclusions sur les Western- Blots correspondant aux souches portant le plasmide pGAL-PDS1-mdb. J’ai déjà souligné le fait que mes expériences étaient parfois difficiles à interpréter lorsque les cellules cyclent moins rapidement (culture avec une transition raffinose/galactose ou culture à 20°C par exemple). Cette expérience en est un autre exemple. Ceci est peut-être dû au fait que les synchronisations sont moins efficaces dans ces conditions. Pour améliorer l’expérience et obtenir des conditions dans lesquelles on voit clairement une différence entre la souche sauvage et le mutant mad2!, dans le

cas où les deux souches portent le plasmide vide et sont incubées en présence de nocodazole, j’ai essayé de changer le moment de l’irradiation (en irradiant 15 min avant ou après le moment opportun). J’ai également essayé de changer de fond génétique (certains fonds restent mieux synchronisés que d’autres après le relargage d’un blocage à l’"-facteur), et/ou d’augmenter la dose d’UV (pour avoir une phosphorylation de Rad53 maintenue plus longtemps dans la souche mad2! traitée au nocodazole). Aucun de ces essais n’a permis d’améliorer le résultat.

Figure n°M10

Puisque les conditions expérimentales censées induire un blocage artificiel de la transition métaphase/anaphase ne nous permettent pas de savoir si la « désactivation » plus rapide de Rad53 induite par le nocodazole après une irradiation UV est due à ce blocage, nous avons essayé de

Influence de la surexpression de PDS1-mdb et du nocodazole sur la réponse aux UV.

Les souches L208 (Y300 bar1!) et L266 (Y300 bar1! mad2!) portant ou non le plasmide p416GAL1/PDS1-mdb-HA (pOC57-HA) sont synchronisées à l’"-facteur en raffinose avant d’être relarguées dans un milieu contenant du galactose en présence ou en absence de nocodazole (15 µg/ml) pendant 1h50. Les cellules sont alors irradiées aux UV (40J/m2_{) puis incubées à nouveau dans un milieu}

contenant du galactose en présence ou en absence de nocodazole comme précédemment. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après irradiation et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre la protéine Rad53.

Résultats et Discussion – Checkpoints de l’ADN et checkpoint du fuseau

supprimer ce blocage dans notre expérience. Pour cela, nous avons utilisé des mutants pds1!.

Nous avons synchronisé les souches pds1! et pds1! mad2! à l’"-facteur à 20°C avant de les

relarguer en présence de nocodazole et de les irradier aux UV lorsque les cellules atteignent la phase G2/M. Si les souches sont incubées à 20°C (température permissive pour le mutant pds1!

(cf figure n°M11A)) après le relargage de l’"-facteur, nous retrouvons le même problème que précédemment : la phosphorylation de Rad53 dans la souche mad2! traitée au nocodazole dans

ces conditions ne semble pas être maintenue (données non montrées). C’est pourquoi nous avons relargué les souches à 30°C après la synchronisation à l’"-facteur. La figure n°M11B présente le résultat obtenu avec en parallèle les contrôles effectués sur une souche sauvage et un mutant mad2! traités ou non au nocodazole. Les expériences contrôles confirment les données obtenues

précédemment, à savoir que la déphosphorylation de Rad53 est plus rapide chez la souche sauvage si elle est traitée au nocodazole. La souche mad2! semble maintenir la phosphorylation

de Rad53 qu’elle soit traitée ou non au nocodazole comme c’était le cas dans l’expérience présentée dans les figures n°5A et 5B. Cependant, les résultats obtenus pour les mutants pds1!

sont difficiles à interprêter avec nos connaissances actuelles sur les fonctions de Pds1. En effet, la souche pds1! traitée au nocodazole maintient un fort taux de phosphorylation de Rad53. Ceci

semblerait indiquer que le blocage à la transition métaphase/anaphase est responsable du phénomène de « désactivation » de Rad53 induit par le nocodazole. Cependant, les souches pds1! et pds1! mad2! traitées au nocodazole ont clairement un comportement différent aux

temps tardifs après irradiation, alors qu’elles devraient toutes les deux maintenir un fort taux de phosphorylation de Rad53. De façon surprenante, Rad53 semble être « sur-activée » après irradiation chez le mutant pds1! lorsque celui-ci est traité au nocodazole.

Figure n°M11

A

YPD 23°C YPD 27°C YPD 30°C YPD 37°C

YPD 20°C + DMSO 1% YPD 20°C + DMSO 1% + Ben 10 µg/ml WT

pds1!

pds1! mad2! mad2!

Résultats et Discussion – Checkpoints de l’ADN et checkpoint du fuseau

Des éléments dans la littérature semblent indiquer que des biais potentiels pourraient être présents dans cette dernière expérience et qu’elle doit être considérée avec précaution. A.Yamamoto et ses collaborateurs ont fait subir le traitement suivant au mutant pds1-1 : synchronisation à l’"-facteur à 23°C, puis incubation à 37°C pendant une heure en maintenant le blocage à l’"-facteur et enfin relargage à 37°C. Ils ont remarqué qu’après avoir subi ce traitement, le mutant n’était pas capable d’atteindre la télophase. Ils ont aussi montré que ce n’était pas le cas, si à la place de l’"-facteur, on bloquait les cellules avec de l’hydroxyurée ou du nocodazole (Yamamoto et al., 1996a). Par ailleurs, ils indiquent que si le mutant pds1-1 est incubé à 37°C entre les points d’arrêt de l’"-facteur et de l’hydroxyurée et qu’il est ensuite réincubé à 23°C, les cellules n’arrivent pas non plus à atteindre la télophase (Yamamoto et al., 1996a). Ils en ont conclu qu’en plus de son rôle dans la ségrégation des chromatides sœurs, Pds1 devait jouer un autre rôle plus tôt dans le cycle. Des éléments suggèrent que ce rôle serait requis

Influence de la délétion de PDS1 et du nocodazole sur la réponse aux UV.

A. La sensibilité des souches L64 (YPH499), L48 (YPH499 mad2!), L199 (YPH499 pds1!) et L273 (YPH499 pds1! mad2!) est testée sur bénomyle et à différentes températures. Des dilutions sérielles au 1/10 de cultures en phase exponentielle sont «spottées» sur les milieux indiqués puis examinées 2 à 5 jours plus tard.

B. Les souches L64 (YPH499), L48 (YPH499 mad2!), L199 (YPH499 pds1!) et L273 (YPH499

pds1! mad2!) sont synchronisées à l’"-facteur à 20°C avant d’être relarguées à 30°C en présence

ou en absence de nocodazole (15 µg/ml) pendant 1h45. Les cellules sont alors irradiées aux UV (40J/m2) puis incubées à nouveau à 30°C en présence ou en absence de nocodazole. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après irradiation et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre la protéine Rad53.

Résultats et Discussion – Checkpoints de l’ADN et checkpoint du fuseau

pour l’élongation du fuseau en anaphase et indispensable à la survie cellulaire à 37°C (Yamamoto et al., 1996a). De façon liée ou non, il a également été montré que Pds1 était nécessaire à l’accumulation d’Esp1 dans le noyau, probablement via l’interaction Pds1/Esp1 qui a lieu pendant la phase S (Agarwal and Cohen-Fix, 2002).

Au cours de mon expérience, les cellules pds1! ont été synchronisées à l’"-facteur à

20°C, puis lavées et reprises dans un milieu également à 20°C avant d’être placées dans un incubateur à 30°C. Je ne sais pas si ce protocole aurait permis aux cellules délétées pour PDS1 de passer le point critique décrit par A.Yamamoto et ses collaborateurs (Yamamoto et al., 1996a). On ne peut pas utiliser un blocage à l’hydroxyurée au lieu de l’"-facteur, qui éliminerait pourtant ce problème, car Rad53 est phosphorylée lors d’un traitement à l’hydroxyurée. On ne peut pas non plus utiliser un mutant thermosensible pour bloquer le cycle puisque des conditions de température sont déjà imposées par la délétion de PDS1. Par ailleurs, nous ne savons pas non plus dans quelle mesure le rôle d’Esp1 est affecté dans cette expérience. Toutefois, les éventuels biais dus aux autres rôles de Pds1 indiqués précédemment ne peuvent expliquer le fait que les souches pds1! et pds1! mad2! se comportent différemment.

2.3.2.5. Conclusion : le traitement au nocodazole modifie la réponse aux