Glc7 et la phosphorylation de Chk

La délétion de CHK1 semble mimer les effets de la surexpression de GLC7 après cassure HO et accélère, comme la surexpression de GLC7, la reprise du cycle lors d’un traitement à la camptothécine chez le mutant ptc2! ptc3!. Nous avons donc voulu tester plus directement

l’hypothèse d’une déphosphorylation de Chk1 par Glc7 lors de l’inactivation du checkpoint. Nous avons ainsi examiné l’influence de la surexpression de GLC7 sur la phosphorylation de Chk1 dans une souche sauvage. Nous avons suivi l’état de phosphorylation de la protéine Chk1-myc après induction de la cassure HO (cf figure n°G13A). L’ajout du tag ne modifie pas la réponse de la souche au stress génotoxique (cf figure n°G13B et données non montrées). Chk1-myc montre une cinétique de phosphorylation similaire à celle de Rad53 après cassure HO. En effet, des formes phosphorylées de cette protéine sont visibles deux heures après l’induction de la coupure et leur abondance est maximale à t=6h puis diminue ensuite entre les temps t=12h et t=18h. Ces données sont en accord avec celles obtenues par l’équipe de J.Haber (Pellicioli et al., 2001). La surexpression de GLC7 ne modifie pas cette cinétique de phosphorylation : les formes phosphorylées de Chk1 sont toujours aussi abondantes et leur apparition et disparition ne sont pas décalées dans le temps.

Nous avons ensuite testé l’influence de Glc7 sur la phosphorylation de Chk1 après une irradiation UV. En effet, comme nous l’avons déjà indiqué, la surexpression de la PP1c Dis2 de S. pombe entraîne une réduction significative de l’abondance des formes phosphorylées de Chk1 après une irradiation UV (den Elzen and O'Connell, 2004). Nous avons voulu déterminer s’il en était de même chez S. cerevisiae. Des cellules en phase exponentielle ont été irradiées avec une dose d’UV égale à 60 J/m2 et l’état de phosphorylation de Chk1-myc a été suivi par Western-Blot (cf figure n°G13C). Des formes phosphorylées de Chk1 sont visibles 20 minutes après irradiation et le sont encore 4 heures plus tard même si elles commencent alors à disparaître. La surexpression de GLC7 n’induit aucune différence sur cette cinétique de phosphorylation.

Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN

Nous avons enfin essayé en vain de mettre en évidence une éventuelle interaction entre Chk1 et Glc7 par trois méthodes différentes (double-hybride, « GST-pulldown », co- immunoprécipitation). Le double-hybride a été étudié sans stress génotoxique. Le « GST- pulldown » a été mené avec des extraits de cellules irradiées ou non aux UV (extraits réalisés sur des cellules 40 min après une irradiation de 60J/m2). L’interaction en co-immunoprécipitation a été testée avec des cellules non stressées en phase exponentielle, avec des cellules prélevées 30 minutes après une irradiation UV de 90 J/m2 et avec des cellules prélevées 4h et 8h après induction de la cassure HO. Il est toutefois possible que nous n’ayons pas trouvé les conditions nécessaires à la détection de cette interaction.

2.8.4. Conclusion

Rien ne nous permet d’affirmer que Glc7 agit sur la désactivation du checkpoint de l’ADN en G2/M via Chk1. Il est vrai que la délétion de CHK1 mime de nombreux phénotypes obtenus en surexprimant GLC7, que ce soit après une cassure HO ou après un traitement à la camptothécine. Cependant, l’absence d’influence de Glc7 sur la cinétique de phosphorylation de Chk1 après un stress génotoxique et l’indépendance des effets de Glc7 par rapport à CHK1 pour les tests de sensibilité à la camptothécine semblent contredire l’hypothèse d’une déphosphorylation directe de Chk1 par Glc7. La surexpression de GLC7 et la délétion de CHK1 entraînant toutes deux une reprise plus rapide du cycle au cours d’un traitement à la

Influence de la surexpression de GLC7 sur l’état de phosphorylation de Chk1.

A. La souche L72 (WT, JKM139 CHK1-myc) portant le plasmide pRS316 ou le plasmide pRS316/GLC7 sont cultivées en milieu liquide contenant du raffinose. On induit l’expression de HO en ajoutant du galactose à t=0. Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après induction et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre le tag Myc.

B. Analyse par FACS des points de la figure n°A.

C. Des cultures de la souche L73 (WT, JKM139 CHK1-myc) portant le plasmide vide pRS316 ou le plasmide pRS316/GLC7, en phase exponentielle, ont été soumises à une irradiation UV (60J/m2_).

Des aliquots sont prélevés aux temps indiqués après irradiation et analysés par Western-Blot avec un anticorps dirigé contre le tag Myc.

Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN

camptothécine chez le mutant ptc2!, il est surprenant qu’elles n’induisent pas le même phénotype

chez ce mutant lors du test de sensibilité à la camptothécine. Pour essayer de mieux comprendre cette différence, nous avons analysé la phosphorylation de Rad53 dans des cellules étalées sur du milieu solide contenant de la camptothécine (à une concentration finale de 7,5 µg/ml) et incubées à 30°C pendant 1, 2 ou 3 jours. On remarque une plus forte abondance des formes phosphorylées de Rad53 chez le mutant ptc2! ptc3! que chez la souche sauvage notamment après 48 heures

(données non montrées). Les surexpressions de GLC7 ou de PTC2 dans ce mutant n’ont pas les mêmes conséquences : la surexpression de PTC2 permet de retrouver le phénotype sauvage, alors que les formes phosphorylées de Rad53 sont aussi abondantes après 48 heures chez le mutant ptc2! ptc3!, qu’il surexprime ou non GLC7. Cette expérience n’a été effectuée qu’une seule fois

et le résultat obtenu doit donc être pris avec précaution. Cela suggère toutefois que les expériences de viabilité sur 2 ou 3 jours et les expériences sur la réponse à la camptothécine sur un cycle cellulaire ne sont pas facilement corrélables.