Glc7 et l’inactivation des mécanismes de surveillance de l’ADN
1.2. Principe du crible à l’origine de l’étude de Glc
L’étude au laboratoire des phosphatases Ptc2 et Ptc3 a montré l’implication de phénomènes de déphosphorylation dans l’inactivation des mécanismes de surveillance de l’ADN. L’activation des checkpoints mettant en jeu une cascade de phosphorylations, il est probable que d’autres phosphatases soient impliquées dans leur désactivation.
Le mutant ptc2! ptc3! est défectueux pour l’adaptation : il montre un défaut de
déphosphorylation de Rad53 et un défaut de reprise du cycle après induction de la cassure HO (Leroy et al., 2003). La majorité des cellules de ce double délétant restent bloquées en G2/M après l’activation du checkpoint de l’ADN, probablement parce qu’elles n’arrivent pas à déphosphoryler Rad53 et donc à inactiver le checkpoint. La surexpression de PTC2 a l’effet inverse et entraîne une reprise plus rapide du cycle. Les cellules subissent alors plusieurs cycles de division et forment des microcolonies de plus de 8 cellules. Elles ne peuvent pour autant former des colonies viables car la résection au niveau des extrémités de la cassure entraîne la perte du chromosome III et de gènes essentiels.
Pour identifier de nouvelles phosphatases impliquées dans le phénomène d’adaptation, un crible a été effectué par Emilie Ma au laboratoire avant mon arrivée. Une souche ptc2! ptc3! a
été transformée par une banque de plasmides multicopies (issus du plasmide pRS426) contenant les gènes de plusieurs phosphatases PSP de Saccharomyces cerevisiae, construite par Chaouki Miled en 1998. Nous avons concentré notre étude sur les PSP car tous les résidus de Rad9 et Rad53 qui ont été identifiés comme étant phosphorylés après un stress génotoxique sont des sérines ou des thréonines (Smolka et al., 2005; Sweeney et al., 2005). Le but du crible était d’identifier une phosphatase dont la surexpression supprime le phénotype du mutant ptc2! ptc3!.
En effet, si une phosphatase est nécessaire au processus de désactivation des checkpoints de l’ADN, il est possible que sa surexpression dans le mutant ptc2! ptc3! améliore l’adaptation de
cette souche, c’est-à-dire qu’elle facilite la reprise du cycle cellulaire et supprime l’arrêt G2/M quasi-permanent de ce mutant.
Si ce crible peut permettre d’identifier des phosphatases spécifiquement impliquées dans le phénomène d’adaptation, qui affectent la déphosphorylation de Rad53 de façon directe ou ou
Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN
indirecte (par exemple en jouant sur Ptc2 et Ptc3), il peut également permettre de trouver des phosphatases dont la surexpression atténue le signal activant le checkpoint de l’ADN, des phosphatases dont la surexpression inhibe l’activité des protéines nécessaires à l’activation de Rad53 ou des phosphatases (ciblées ou non par le checkpoint) dont la surexpression supprime seulement le blocage du cycle dû au stress génotoxique, indépendamment de l’activité du checkpoint de l’ADN. D’autres mécanismes plus compliqués ou moins physiologiques qui permettraient à une phosphatase surexprimée de supprimer le phénotype du mutant ptc2! ptc3!
ne sont bien évidemment pas exclus.
1.3. Le crible
Un test d’adaptation a été effectué sur les souches issues de la transformation par la banque. Comme contrôle, nous avons utilisé la souche ptc2! ptc3! portant le plasmide vide
pRS426. Les résultats sont montrés figure n°G2. Nous pouvons observer que près de 70% des cellules du mutant ptc2! ptc3! restent bloquées en G2/M. La surexpression de nombreuses
phosphatases n’influence pas l’adaptation du double délétant. Seule la surexpression de GLC7, gène codant pour la sous-unité catalytique de la PP1, supprime le défaut d’adaptation du mutant de façon significative. Figure n°G2 Nombre de cellules 2 3 4 5 6 7 > = 8 vecteur vide 6 8 1 1 1 0 9 2 0 0 GLC7 (GC) 8 1 5 1 6 3 5 1 2 4 1 0 P P 1 GLC7 (PC) 8 0 7 8 1 2 1 1 P P 1 PPH21 7 8 1 3 8 1 0 0 0 PP2A PPH22 6 7 1 4 7 9 3 0 0 PP2A P P H 3 7 1 1 5 7 4 3 0 0 PP2A-relate d S I T 4 7 2 1 5 6 3 4 0 0 PP2A-relate d P P G 1 7 4 8 8 9 1 0 0 PP2A-relate d C N A 1 6 9 1 3 1 1 4 1 0 2 PP2B C N A 2 7 1 1 3 9 3 2 2 0 PP2B P T C 4 6 6 1 6 5 9 2 1 1 PP2C P T C 5 6 2 1 0 1 7 5 3 1 2 PP2C P T C 6 5 0 2 4 1 2 8 2 0 4 PP2C P P Z 1 7 7 1 0 7 3 2 0 1 PPZ
Cependant, lors de la transformation par le plasmide pRS426/GLC7, des clones de taille
Crible visant à identifier de nouvelles phosphatases impliquées dans l’inactivation des checkpoints de l’ADN.
Test d’adaptation effectué sur les souches issues de la transformation de la souche MCM322 (lev348
ptc2! ptc3!) par une banque de plasmides 2µ de base pRS426 dans lesquels ont été insérés les gènes
codant pour 12 phosphatases de S. cerevisiae. Les valeurs représentées correspondent aux proportions de microcolonies comportant 2 cellules, 3 cellules, 4 cellules,… comptabilisées à l’issue du test d’adaptation.
Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN
hétérogène ont été obtenus. Sur la boîte de transformation, au milieu d’un tapis de petits clones (PC) poussent une vingtaine de gros clones (GC) aux bords irréguliers. Petits clones et gros clones ont été testés séparément pour l’adaptation. Seuls les gros clones ne présentent plus le défaut d’adaptation du mutant ptc2! ptc3!. Pour étudier plus en détail les gros clones, l’ADN
plasmidique de quelques-uns a été extrait et amplifié par transformation chez E. coli. Les plasmides issus des GC ont été vérifiés par digestion et étaient semblables au plasmide originel (pRS426/GLC7). La souche ptc2! ptc3! a alors été retransformée avec les plasmides issus des
gros clones : cette fois-ci la taille des transformants était homogène, avec un tapis de petits clones ronds sans aucune distinction PC/GC. Par ailleurs, le défaut d’adaptation de la souche initiale (JKM139 ptc2! ptc3!) n’était plus complémenté… Ce phénomène reste inexpliqué. Comme
nous l’avons souligné dans l’introduction, il a déjà été constaté qu’une forte surexpression de GLC7 était toxique, voire létale dans une souche sauvage (Black et al., 1995; Francisco et al., 1994; Hisamoto et al., 1994). Le phénotype GC/PC pourrait provenir d’un effet secondaire de cette toxicité. Pour étudier de façon correcte l’effet de la surexpression de la PP1 sur l’adaptation, GLC7 a été recloné dans des plasmides centromériques (pRS316 et pRS314). La taille des clones obtenus après transformation avec ces plasmides était cette fois homogène.