Influence de la délétion de MAD2 sur la réponse à la camptothécine

Des tests de sensibilité ont été réalisés pour étudier l’effet de l’invalidation de MAD2 sur la réponse à la camptothécine. Les mutants du checkpoint du fuseau ne montrent pas d’hypersensibilité aux stress génotoxiques, comme les rayonnements UV et !, la phléomycine, la camptothécine et le 4-NQO (cf figure n°G18A, données non montrées et (Hoyt et al., 1991)). La sensibilité des mutants ptc2! à la camptothécine est à nouveau visible sur la figure n°G18A. Par

contre, contrairement à la surexpression de GLC7, la délétion de MAD2 ne supprime pas l’hypersensibilité de ces mutants à la camptothécine. De plus, l’effet de Glc7 sur l’hypersensibilité à la camptothécine est toujours visible chez le double mutant ptc2! mad2! et

est comparable à celui induit chez le simple mutant ptc2!, suggérant que cet effet est indépendant

de MAD2 (cf figure n°G18A).

Figure n°G18

YPD + DMSO 1% YPD + DMSO 1% + Cpt 5µg/ml WT + pRS316 + pRS314 mad2! + pRS316 + pRS314 ptc2! + pRS316 + pRS314 ptc2! mad2! + pRS314 ptc2! mad2! + pRS314/GLC7 ptc2! + pRS316 + pRS314/GLC7 WT + pRS316 + pRS314/GLC7 mad2! + pRS316 + pRS314/GLC7 YPD + DMSO 1% + Cpt 7,5µg/ml YPD + DMSO 1% + Cpt 10µg/ml YPD + DMSO 1% + Cpt 12,5µg/ml

A

YPD + DOX + DMSO 1% tet-RAD53-GFP + pRS316 tet-RAD53-GFP + pRS316/GLC7 tet-RAD53-GFP mad2! + pRS316 tet-RAD53-GFP mad1! + pRS316 WT + pRS316 WT + pRS316/GLC7 WT + pRS316/PTC2

B

YPD + DOX + DMSO 1% + Cpt 4µg/ml

YPD + DOX + DMSO 1% + Cpt 6µg/ml

Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN

Nous avons également testé l’influence de MAD2 sur la survie en présence de l’allèle dominant létal tetO-RAD53-GFP. Cet allèle contient la séquence codant Rad53 fusionnée à la séquence codant pour la GFP (« Green Fluorescent Protein »). Cette fusion est placée sous le contrôle de l’opérateur tetO qui est réprimé en présence de tétracycline ou de ses dérivés comme la doxycycline (Marsolier et al., 2000). Cet allèle se comporte comme une forme hyperactive de RAD53, capable d’activer des cibles de Rad53, et est délétère chez une souche sauvage (Marsolier et al., 2000). Pour notre étude, nous avons utilisé une souche construite par Anne Peyroche dans laquelle cet allèle est intégré au niveau du locus TRP1 (souche CHKY001-5). L’intégration de cette construction conduit à un phénotype plus fort que sa présence sur un plasmide et empêche totalement la croissance en absence de doxycycline. La fusion Rad53-GFP, comme la protéine Rad53 endogène, sont alors hyperphosphorylées (Anne Peyroche, communication personnelle). Comme le montre la figure n°G18B, même en présence de doxycycline, cette souche est hypersensible à la camptothécine, certainement à cause d’une fuite de l’opérateur tetO. La surexpression de PTC2 supprime partiellement cette hypersensibilité. Ptc2 déphosphoryle probablement les formes hyperactives et hyperphosphorylées de Rad53, rendant l’allèle moins toxique. La figure n°G18B indique aussi que la surexpression de GLC7 supprime partiellement l’hypersensibilité de cette souche à la camptothécine. Ceci est en accord avec l’idée d’un rôle de Glc7 dans l’inactivation des checkpoints de l’ADN.

Par contre, les délétions de MAD1 ou MAD2 ne suppriment pas l’hypersensibilité de la souche CHKY001-5 à la camptothécine (cf figure n°G18B). Nous avons aussi testé l’influence de la délétion de MAD1 ou de MAD2 sur la croissance d’une souche sauvage portant un plasmide contenant la fusion tetO-RAD53-GFP en absence de doxycycline (Marsolier et al., 2000). Aucune différence n’a été observée entre la souche sauvage et les délétants mad1! et mad2! (données

non montrées). Ainsi, l’inactivation du checkpoint du fuseau ne restaure pas systématiquement la viabilité de cellules dont les checkpoints de l’ADN sont anormalement hyperactifs.

Nous avions observé une déphosphorylation plus rapide de Rad53 chez les doubles mutants ptc2! mad1! et ptc2! mad2! après cassure HO. Nous avons donc analysé la

phosphorylation de Rad53 et de Rad53-GFP en absence de doxycycline dans les souches sauvage et mad2! portant le plasmide contenant la fusion tetO-RAD53-GFP. Aucune différence n’a été

observée en Western-Blot entre les deux souches (données non montrées). Cependant, en absence de doxycycline, les formes Rad53-GFP sont beaucoup plus abondantes lorsque la construction est intégrée que lorsqu’elle est portée par un plasmide. Nous pourrions donc utiliser la souche

Effets comparés de la surexpression de GLC7 et de la délétion de MAD2 sur la réponse à la camptothécine et à l’allèle tetO-RAD53-GFP.

A. La sensibilité des souches MCM336 (WT, JKM139), L25 (JKM139 mad2!), L196 (JKM139 ptc2!) et L275 (JKM139 ptc2! mad2!) portant un plasmide vide (pRS316 et/ou pRS314) et/ou le plasmide pRS314/GLC7 est testée pour différentes concentrations de camptothécine. Des dilutions sérielles au 1/10 de cultures en phase exponentielle sont «spottées» sur les milieux indiqués puis incubées à 30°C. Elles sont examinées 2 à 3 jours plus tard.

B. La sensibilité des souches L49 (YPH499 tetO-RAD53-GFP), L52 (YPH499 tetO-RAD53-GFP

mad2!), L51 (YPH499 tetO-RAD53-GFP mad2!) et MCM001 (WT, YPH499) portant le plasmide

vide pRS316, le plasmide pRS316/GLC7 ou le plasmide pRS316/PTC2 est testée sur des milieux contenant de la doxycycline et différentes concentrations de camptothécine. Des dilutions sérielles au 1/10 de cultures en phase exponentielle faites en milieu sélectif contenant de la doxycycline sont «spottées» sur les milieux indiqués puis incubées à 30°C. Elles sont examinées 2 à 3 jours plus tard.

Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN

CHKY001-5 pour cette étude. De plus, l’état de phosphorylation de Rad53 n’a été étudié qu’aux temps t=2h, 4h et 6 heures après relargage dans un milieu sans doxycycline. Nous pourrions analyser des points plus tardifs.

2.9.1.3. Conclusion

L’étude de la construction tetO-RAD53-GFP constitue un élément de plus en faveur d’un rôle de Glc7 dans l’inactivation des mécanismes de surveillance de l’ADN. La surexpression de GLC7 semble en effet diminuer la toxicité de cet allèle dominant létal qui induit de façon artificielle une hyperactivation de Rad53. Les tests de sensibilité ne semblent pas être en accord avec l’idée d’un effet indirect de Glc7 sur l’inactivation des checkpoints de l’ADN via Mad1 et Mad2. Pourtant, il est possible que la surexpression de GLC7 ait d’autres effets (en plus d’un éventuel impact sur le checkpoint du fuseau) permettant d’améliorer la viabilité en présence d’une activation permanente des checkpoints de l’ADN.

Les résultats obtenus avec la délétion de MAD2 sont analogues à ceux obtenus avec la délétion de CHK1. Les conclusions que l’on peut en tirer sont limitées. Cependant, il serait intéressant de tester la progression dans le cycle du double mutant ptc2! mad2! lors d’un

traitement à la camptothécine, comme nous l’avons fait pour le mutant chk1! mad2!. De même,

la sensibilité du mutant chk1! à l’allèle tetO-RAD53-GFP pourrait être étudiée. La comparaison

entre les effets de la délétion de CHK1 et ceux de la délétion de MAD2 serait intéressante et aboutirait peut-être à l’hypothèse d’une voie commune, comprenant Mad2 et Chk1, nécessaire au maintien du checkpoint de l’ADN en G2/M.