Glc7 et l’inactivation des checkpoints de l’ADN

3.1.1. La déphosphorylation de Rad53 est requise pour la reprise du cycle après une cassure HO ou un traitement à la camptothécine.

Nos résultats suggèrent que la phosphatase Ptc2 est requise pour l’inactivation des checkpoints de l’ADN après cassure HO ou traitement à la camptothécine. Suite à l’un de ces deux stress, le mutant ptc2! montre en effet un défaut de déphosphorylation de Rad53 et un

défaut de reprise du cycle. Cette activation trop longue du checkpoint pourrait être à l’origine de la sensibilité de ce mutant à la camptothécine comme elle l’est pour son défaut d’adaptation et de rétablissement après cassure HO. Plus précisément, l’étude de l’allèle ptc2-T376A suggère que le rôle de Ptc2 dans ces processus cellulaires est au moins en partie de déphosphoryler Rad53. Ainsi, cette déphosphorylation constitue un élément clé du processus conduisant à l’adaptation ou au rétablissement. À ce jour, les mécanismes permettant l’inactivation des checkpoints de l’ADN sont encore mal connus. Il a été montré que l’inactivation de Rad53 ou Mec1, via l’utilisation d’allèles thermosensibles, 10 heures après l’induction de la cassure HO dans le mutant d’adaptation cdc5-ad induisait une reprise du cycle cellulaire. De plus, dans le cas de l’inactivation de Mec1, les auteurs montrent conjointement une déphosphorylation prononcée de Rad53 (Pellicioli et al., 2001). L’arrêt permanent des mutants d’adaptation nécessite donc une activité continue des kinases du checkpoint. Ces kinases, notamment Rad53 et Chk1, sont d’ailleurs désactivées au moment où les cellules adaptent (Pellicioli et al., 2001). Ces données et les nôtres suggèrent que l’inactivation de la cascade en amont du checkpoint est un élément nécessaire et suffisant au rétablissement et à l’adaptation.

Le rôle de Ptc2 a été mis en évidence dans le cas de la cassure HO par (Leroy et al., 2003). Nos résultats montrent ici que la même fonction de Ptc2, à savoir la déphosphorylation de Rad53, est probablement requise pour la reprise du cycle lors d’un traitement à la camptothécine. La camptothécine est considérée comme une drogue induisant des cassures double-brin de l’ADN. Il semble donc normal que la réponse à cette drogue nécessite les mêmes mécanismes que ceux mis en place pour la réponse à la cassure HO. Pourtant, le mutant ptc2! n’est pas

hypersensible aux stress comme les rayons ! ou la phléomycine qui sont également décrits comme induisant des cassures double-brin de l’ADN. Le nombre de cassures double-brin produites dans une cellule est un élément déterminant pour l’adaptation. Il a en effet été montré que les cellules sauvages n’adaptaient pas en présence de deux cassures HO. Comme nous l’avons déjà souligné, il est possible que, contrairement à la camptothécine et à la cassure HO, la phléomycine et les rayons ! induisent un nombre plus variable de cassures double-brin dans les

Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN

cellules ou des dommages plus hétérogènes, ce qui diminuerait le nombre de cellules dont la survie serait conditionnée par l’activité de Ptc2.

Le mutant ptc2! est également sensible au 4-NQO (données non montrées). Cependant, la

complémentation de ce mutant par le plasmide pRS316/PTC2-T376A ne supprime que partiellement son hypersensibilité au 4-NQO (données non montrées). Ceci pourrait suggérer que Ptc2 a d’autres fonctions en plus de son rôle vis-à-vis de Rad53 dans la réponse au 4-NQO.

3.1.2. Glc7 est impliquée dans une voie modulant l’inactivation des checkpoints de l’ADN après une cassure HO ou un traitement à la camptothécine.

Nos résultats montrent que Glc7 est également impliquée dans l’inactivation des checkpoints de l’ADN. Cependant son rôle n’a réellement pu être caractérisé qu’en présence d’un checkpoint « suractivé ». Ainsi, une influence de Glc7 a été mise en évidence chez plusieurs mutants défectueux pour l’adaptation ou le rétablissement après cassure HO, chez le mutant ptc2! après un traitement à la camptothécine et en présence de l’allèle tetO-RAD53-GFP. Glc7

pourrait avoir un rôle mineur dans l’adaptation et le rétablissement en cas de stress génotoxique. Mais il est aussi possible que nos moyens d’investigation, limités par la létalité de la forte surexpression ou de la délétion de GLC7, ne nous aient pas permis de démontrer une implication plus forte de Glc7 dans la désactivation du checkpoint. Le fait que la surexpression modérée de PTC2 via le plasmide pRS316/PTC2 ne modifie pas de façon drastique le comportement de la souche sauvage (cf figure n°G6, G9B et G18) alors que Ptc2 est nécessaire à l’inactivation du checkpoint après une cassure HO ou lors d’un traitement à la camptothécine, et que la surexpression modérée de GLC7 via le plasmide pRS316/GLC7 ait les mêmes effets que celle de PTC2 chez cette même souche sauvage conforte cette idée. Par ailleurs, la multiplicité des contextes dans lesquels un effet de Glc7 a pu être mis en évidence (plusieurs mutants d’adaptation différents, plusieurs stress génotoxiques différents, l’activation artificielle via tetO- RAD53-GFP) affaiblit l’hypothèse d’un effet indirect.

Nous pensons que l’inactivation du checkpoint après une cassure double-brin de l’ADN nécessite la désactivation des protéines en amont du checkpoint et notamment la désactivation de Rad53 par sa déphosphorylation. Les effets de Glc7 que nous observons mènent donc à deux hypothèses :

• soit Glc7 est impliquée dans une voie qui module directement l’état de phosphorylation de Rad53,

• soit Glc7 agit sur une ou des voies permettant à la cellule de se passer de la désactivation des protéines en amont du checkpoint et force la reprise du cycle en jouant sur des éléments en aval ou en parallèle du checkpoint. La déphosphorylation de Rad53 observée pourrait alors être le résultat d’une boucle de régulation ou plus indirectement de la progression dans le cycle, puisqu’il a été montré que Rad53 n’était pas activée en G1 en cas de cassure double-brin (Ira et al., 2004; Pellicioli et al., 2001).

Le fait que la surexpression de GLC7 ne montre que des effets similaires à ceux de la surexpression de PTC2 conforte la première hypothèse, même si la seconde ne peut être totalement exclue. Cette hypothèse conduit à penser que Glc7 agit dans une voie permettant de réguler l’état de phosphorylation de Rad53 au cours de la désactivation du checkpoint, voie distincte de celle de Ptc2.

Résultats et Discussion – Glc7 et les checkpoints de l’ADN

La surexpression de GLC7 complémente les défauts de déphosphorylation de Rad53 et de reprise du cycle du mutant ptc2! en cas de cassure HO et du mutant ptc2! ptc3! lors d’un

traitement à la camptothécine. Cependant cette complémentation n’apparait que partielle lors des tests d’adaptation à la cassure HO et des tests de sensibilité à la camptothécine (cf figures n°G3, n°G9 et données non montrées). Cela pourrait être dû au fait que nous ne pouvons surexprimer GLC7 que de façon modérée. Mais il est également possible que la surexpression de GLC7 ait des effets délétères sur la croissance ou sur la réparation indépendamment de son rôle dans le checkpoint. Si tel était le cas, cet effet délétère devrait toutefois être visible sur la souche sauvage dans ces tests. Rien de tel n’a été observé. Ptc2 pourrait avoir d’autres cibles et ainsi inactiver plus efficacement d’autres voies du checkpoint. Il a été montré par exemple que Wip1, l’homologue fonctionnel de Ptc2 chez les mammifères, inactivait Chk1 (Lu et al., 2005). L’analyse de l’allèle PTC2-T376A semblerait alors suggérer que la phosphorylation de Ptc2 serait nécessaire à ces autres rôles. D’autres explications sont tout à fait envisageables.

L’hypothèse d’une voie distincte de celle nécessitant Ptc2 permettant la déphosphorylation de Rad53 et dans laquelle serait impliquée Glc7 conduit à se demander quelle serait la signification physiologique de l’existence de plusieurs voies. En Western-Blot, Rad53 montre des profils de phosphorylation différents en fonction du stress génotoxique. C’est le cas par exemple pour ceux obtenus après une cassure HO ou un traitement à la camptothécine. Les formes phosphorylées de Rad53 après ces deux stress ne sont donc sûrement pas exactement les mêmes. Les études des sites de Rad53 phosphorylés en cas de traitement au MMS ou au 4-NQO montrent que ces deux stress génotoxiques n’engendrent pas la phosphorylation du même ensemble de sites (Smolka et al., 2005; Sweeney et al., 2005). Les événements de phosphorylation pourraient également dépendre de la phase du cycle et/ou de la quantité de dommages. L’existence de plusieurs voies impliquées dans la déphosphorylation de Rad53 pourrait ainsi permettre une désactivation adaptée de Rad53 quelles que soient les conditions de son activation. Il est intéressant de noter que la surexpression de GLC7 ne corrige que partiellement l’absence de déphosphorylation de Rad53 du mutant ptc2! ptc3! en cas de cassure

HO (cf figure n°G5A) alors qu’elle permet de retrouver un phénotype sauvage lors d’un traitement à la camptothécine (cf figure n°G9D). L’existence de plusieurs voies de déphosphorylation de Rad53 pourrait résulter de la réponse spécialisée que la cellule met en place pour chaque stress.

Certains sites de phosphorylation de Rad53 pourraient être communs aux différents stress et d’autres plus spécifiques. L’idée d’un jeu de phosphatases ciblant directement ces différents sites avec potentiellement une certaine redondance est séduisante. Nous avons essayé de mettre en évidence une éventuelle interaction entre Glc7 et Rad53 par les techniques de double-hybride, de « GST-pulldown » et de co-immunoprécipitation. L’échec de ces investigations nous a amenés à chercher par quel autre mécanisme Glc7 pouvait influer sur l’inactivation des checkpoints de l’ADN.