Les caractéristiques du doublet

2.2.1. Le doublet ne semble pas correspondre à une forme active de Rad53.

Lors d’un stress génotoxique ou réplicatif, on pense que Rad53 est phosphorylée par Mec1/Tel1 lors d’une interaction favorisée par un adaptateur (Rad9 ou Mrc1). Elle s’autophosphoryle ensuite en trans avant d’agir sur les éventuels effecteurs loin des sites de dommages. Un test d’autophosphorylation sur membrane mis au point par A.Pellicioli et ses collaborateurs (Pellicioli et al., 1999) permet d’évaluer l’activité d’autophosphorylation de Rad53. Ainsi, le signal obtenu lors de ce test est important lorsque les extraits protéiques ont été faits à partir de cellules ayant subi un stress génotoxique ou réplicatif (traitement à l’hydroxyurée, au MMS, aux UV) (cf figure n°1F et (Pellicioli et al., 1999)). Comme le montre la figure n°1F, ce test semble indiquer que le traitement au nocodazole ne modifie pas l’activité d’autophosphorylation de Rad53 en présence ou en absence d’un stress génotoxique.

Les gènes codant pour les sous-unités de la ribonucléotide réductase RNR2 et RNR3 subissent une induction transcriptionnelle dépendante de RAD53 lors d’un stress génotoxique ou réplicatif (Allen et al., 1994; Zhou and Elledge, 1993). Cette induction est considérée comme un marqueur de l’activation de la voie Rad53 et peut être testée en suivant l’expression des gènes rapporteurs RNR2-lacZ et RNR3-lacZ construits en juxtaposant le promoteur de RNR2 ou de RNR3 et le gène lacZ (Zhou and Elledge, 1992). Le gène lacZ code pour la %-galactosidase. Le fait que cette enzyme soit capable d’hydrolyser un substrat incolore, l’ONPG, en galactose et en un produit jaune, l’ONP, qui absorbe à 420 nm, permet de mesurer son activité in vitro. L’absorption à cette longueur d’onde permet donc d’estimer l’activité transcriptionnelle des gènes RNR2-lacZ et RNR3-lacZ. Des tests préliminaires semblent indiquer que l’activité transcriptionnelle de RNR2-lacZ et RNR3-lacZ n’augmente pas après un traitement au nocodazole.

Ces deux données suggèrent que la bande supérieure du doublet ne correspond pas à une forme active de Rad53 au sens d’une activation engendrée par un stress génotoxique. Ainsi, le traitement au nocodazole ne semble pas activer la voie Rad53 des checkpoints de l’ADN.

2.2.2. La ou les kinases responsables de la phosphorylation de Rad53 induite par le nocodazole

2.2.2.1. Bub1 et Mps1

Résultats et Discussion – Checkpoints de l’ADN et checkpoint du fuseau

connues du checkpoint du fuseau (cf figures n°3A et 3C). Par ailleurs, il a été montré chez l’homme que Mps1 interagissait avec Chk2 en co-immunoprécipitation et que Mps1 phosphorylait Chk2 in vitro (Wei et al., 2005). Nous avons donc essayé de détecter une interaction en co-immunoprécipitation entre Bub1 et Rad53 et entre Mps1 et Rad53. Les expériences menées n’ont pas permis de montrer une telle interaction.

On observe une accumulation de formes phosphorylées de Mad1 dépendante de MAD2, BUB1 et BUB3 en cas de traitement au bénomyle ou au nocodazole (Hardwick and Murray, 1995). Le fait que la surexpression de MPS1 induise une accumulation de ces formes phosphorylées de façon indépendante de MAD2, BUB1 et BUB3 a conduit à l’hypothèse que Mps1 serait la kinase responsable de la phosphorylation de Mad1 en cas de dommages du fuseau (Hardwick et al., 1996). La surexpression de MPS1 donne lieu, comme l’ajout de nocodazole dans le milieu de culture, à la formation du doublet, mais, contrairement à la phosphorylation de Mad1, celle de Rad53 est dépendante de MAD2 dans les deux cas (cf figures n°3A et 3E). Il est donc peu probable que Mps1 soit la kinase responsable de la phosphorylation de Rad53 en cas de dommages du fuseau, même si l’on ne peut exclure le fait que Mad2 puisse jouer un rôle, par exemple d’adaptateur, dans ce mécanisme. Ainsi, aucune donnée ne nous permet de penser que Bub1 ou Mps1 sont la ou les kinases responsables de la formation du doublet.

2.2.2.2. Cdc5

Comme nous l’avons déjà souligné, Cdc5 est une « polo-like » kinase qui intervient dans de nombreux processus mitotiques. Elle est notamment impliquée dans les voies FEAR et MEN et est également responsable d’une phosphorylation de Scc1 qui promeut le clivage de la cohésine par la séparase à la transition métaphase/anaphase. Le taux de Cdc5 varie au cours du cycle, augmente en phase S avant d’atteindre un maximum en mitose. En phase G1, Cdc5 est dégradée de façon dépendante d’APC/Cdh1 (Cheng et al., 1998).

Bfa1 et Bub2 subissent des événements de phosphorylation en mitose dont certains sont probablement responsables de l’inactivation de la GAP et de la sortie mitotique. Ces phosphorylations supprimeraient l’inhibition de Tem1 par Bub2/Bfa1 (Hu and Elledge, 2002; Hu et al., 2001). L’activation du checkpoint du fuseau induite par un traitement au nocodazole semble empêcher l’apparition de ces phosphorylations (Hu and Elledge, 2002; Hu et al., 2001). Ces phosphorylations dépendent au moins partiellement de CDC5 (Hu and Elledge, 2002; Hu et al., 2001), ce qui suggère que le checkpoint pourrait agir sur la kinase Cdc5 pour freiner la progression du cycle. Par ailleurs, il a été montré que Mad3 était phosphorylée en mitose de façon dépendante de CDC5 et que ces formes phosphorylées s’accumulaient après activation du checkpoint du fuseau (Rancati et al., 2005). Cdc5 pourrait donc être une cible du checkpoint du fuseau et/ou une protéine nécessaire à son fonctionnement.

Cdc5 est phosphorylée de façon dépendante de RAD53 dans les cellules cdc13-1 lorsque celles-ci sont placées à température restrictive (Cheng et al., 1998). La surexpression de CDC5 à l’aide du promoteur GAL, induit une élongation du fuseau chez le mutant cdc13-1 à température restrictive, ce qui suggère que cette surexpression permet de supprimer l’inhibition de l’anaphase induite par le checkpoint (Sanchez et al., 1999). Par ailleurs, la délétion de RAD53 permet aux cellules cdc13-1 de séparer leurs chromatides sœurs. La mutation cdc5-1 supprime partiellement cet effet, alors que ce mutant n’est pas défectueux pour l’entrée en anaphase en absence de stress. En effet, le mutant simple cdc5-1 s’arrête à température restrictive à un stade de la mitose où l’activité Cdc28/Clb est forte, après la dégradation de Pds1 et l’allongement du fuseau (Sanchez et al., 1999). Ainsi, Rad53 pourrait inhiber Cdc5 pour bloquer l’entrée en anaphase et la sortie de

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mitose. Enfin, nous avons vu que le mutant cdc5-ad est défectueux pour l’adaptation après cassure HO (Toczyski et al., 1997). Ce mutant est par ailleurs sensible au 4-NQO (données non montrées). L’ensemble de ces données suggèrent que Cdc5 pourrait être une cible des checkpoints de l’ADN impliquée dans le blocage de la progression du cycle en cas de dommages de l’ADN et qu’elle pourrait également être nécessaire à la reprise du cycle en cas de persistance de ces dommages.

À cause de ses liens étroits avec la mitose et les checkpoints, nous avons voulu savoir si la kinase Cdc5 pouvait être responsable de la phosphorylation de Rad53 induite par le nocodazole. Des tests préliminaires semblent indiquer que le doublet pourrait être légèrement atténué dans les cellules cdc5-ad après 1h30 et 3h de traitement au nocodazole. Cependant, ce résultat est à confirmer. De plus, il serait absolument nécessaire de suivre précisément la progression de la mitose en même temps que la cinétique d’apparition du doublet pour éliminer un éventuel biais lié à un mauvais arrêt du cycle chez ce mutant. Si Cdc5 est la kinase responsable de la formation du doublet, il est possible que la surexpression de CDC5 induise sa formation en absence de dommages du fuseau. Ainsi, nous avons suivi l’état de phosphorylation de Rad53 dans des cellules portant un plasmide pGAL-CDC5 plaçant l’expression de CDC5 sous le contrôle du promoteur GAL inductible par le galactose. Ces cellules ont été préalablement synchronisées à l’"-facteur en raffinose avant d’être relarguées dans un milieu contenant du galactose. Comme contrôle, une culture analogue a été relarguée dans un milieu contenant du galactose et du nocodazole. Le doublet est moins bien visible lors d’expériences avec des transitions raffinose/galactose, peut-être à cause du ralentissement du cycle que cela engendre et de la mauvaise synchronisation qui en résulte. Toutefois, en présence de nocodazole, le doublet est clairement présent 3 heures après le relargage. Par contre, la seule surexpression de CDC5 ne permet pas de le voir à ce moment-là. Pour empêcher la progression dans le cycle malgré la présence de nocodazole que pourrait induire la surexpression de CDC5 et qui pourrait éventuellement empêcher de voir le doublet, nous avons réitéré l’expérience avec des cellules portant le vecteur pGAL-Pds1-mdb1. La présence de ce vecteur induit un blocage des cellules à la transition métaphase/anaphase puisqu’il permet la surexpression d’une forme non dégradable de Pds1. Nous avons vu que la présence de ce plasmide n’induit pas la formation du doublet (cf figure n°3F). Après une synchronisation à l’"-facteur dans un milieu sélectif contenant du raffinose, une souche sauvage portant les plasmides pGAL-PDS1-mdb et pGAL-CDC5 est relarguée dans un milieu contenant du galactose. L’étude de l’état de phosphorylation de Rad53 toutes les demi-heures pendant 4h30 après relargage indique clairement que la surexpression de CDC5 n’engendre pas la formation du doublet dans ces conditions. Il est toutefois possible que Cdc5 doive être modifiée après activation du checkpoint du fuseau pour pouvoir agir sur Rad53.

2.2.2.3. Cdc28

Cdc28 est une protéine clé de la régulation du cycle cellulaire. Nous avons voulu savoir si cette kinase était nécessaire à la phosphorylation de Rad53 induite par le nocodazole. Pour cela, nous avons utilisé la souche cdc28-as qui nous a été gracieusement envoyée par K.Shokat. La kinase Cdc28-as correspond à la kinase Cdc28 dont la poche de liaison à l’ATP a été légèrement modifiée pour que puisse s’insérer spécifiquement (et uniquement dans cette kinase) un analogue

1

Il s’agit du vecteur p415GAL1/PDS1-mdb-HA correspondant au vecteur pOC57-HA, gracieusement fourni par Orna Cohen-Fix, dont le marqueur d’auxotrophie a été changé.

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de l’ATP, par exemple le 1-NAPP1, qui agit alors comme un inhibiteur pour la kinase « as » (« analog-sensitive »). Une fois ajouté dans le milieu de culture, l’inhibiteur semble pénétrer dans la cellule et être efficace en seulement quelques minutes (Bishop et al., 2000). En absence d’inhibiteur, le mutant cdc28-as montre une viabilité normale, mais les cellules sont légèrement plus grosses que les cellules sauvages et ont des bourgeons très allongés. Leur temps de génération est également augmenté de 20% (Bishop et al., 2000). J’ai tout d’abord vérifié que le traitement au nocodazole de la souche cdc28-as en absence d’inhibiteur induisait bien la formation du doublet comme c’est le cas dans la souche sauvage. Après une synchronisation à l’"-facteur et un relargage en présence de nocodazole, j’ai pu constater que l’intensité de la phosphorylation de Rad53 était identique à celle observée dans une souche sauvage. La cinétique d’apparition du doublet en Western-Blot était toutefois retardée d’une demi-heure dans la souche cdc28-as par rapport à la souche sauvage, probablement à cause du cycle ralenti de cette souche, que j’ai d’ailleurs pu constater via une analyse par FACS. Ainsi, le doublet de Rad53 apparaît après une heure et demie dans la souche sauvage et après deux heures dans la souche cdc28-as. Il est ensuite maintenu de façon correcte chez le mutant (données non montrées). J’ai ensuite testé l’effet de l’inhibiteur 1-NAPP1 sur la formation du doublet de Rad53. Pour cela, j’ai synchronisé la souche cdc28-as avec de l’"-facteur avant de la relarguer dans un milieu contenant du nocodazole. J’ai effectué plusieurs tests en parallèle (cf schéma de la figure n°M3A). Le test n°1 correspond à un contrôle : la souche cdc28-as a été incubée 1h30 en présence de nocodazole. Pour le test n°2, la souche cdc28-as est incubée 3 heures en présence de nocodazole dont 1h30 en présence de l’inhibiteur. Le test n°4 correspond à une incubation de 4 heures de la souche cdc28- as en présence de nocodazole avec ajout de l’inhibiteur une heure avant la fin du test. Les tests n°3 et 5 correspondent à une incubation de 3 heures et 4 heures respectivement en présence de nocodazole et sont les expériences contrôles des tests n°2 et 4 respectivement. L’analyse par FACS (cf figure n°M3C) permet de vérifier que les cellules sont bien restées bloquées en phase G2/M et n’ont pas progressé dans le cycle au cours de l’expérience. L’analyse par Western-Blot de Rad53 révèle que le doublet est présent seulement dans les tests n°3 et 5 (cf figure n°M3B). Ce résultat indique que Cdc28 est nécessaire à la formation, mais également au maintien de la phosphorylation de Rad53 induite par le nocodazole.

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Figure n°M3

Cependant, plusieurs études suggèrent que Cdc28 serait nécessaire au maintien de l’arrêt induit par le checkpoint du fuseau chez Saccharomyces cerevisiae. Ainsi, si l’on surexprime SIC1, un inhibiteur des complexes Cdk/Clb, dans des cellules préalablement arrêtées au nocodazole, les chromatides sœurs se séparent de façon dépendante de l’APC, indiquant que l’arrêt n’est plus maintenu (Amon, 1997). En condition restrictive, l’allèle cdc28-5M entraîne la perte concomitante de l’activité Cdk et de la capacité à arrêter le cycle suite à des dommages du fuseau ou des dommages de l’ADN (Li and Cai, 1997). Enfin, les allèles cdc28-R288G et cdc28- R10G, qui semblent complémenter correctement les fonctions végétatives de Cdc28 à 30°C et qui semblent avoir conservé leur activité kinase, montrent des défauts partiels pour la réponse aux dommages du fuseau. Par exemple, ces mutants ne sont pas capables de s’arrêter en G2/M de façon correcte lors d’un traitement au nocodazole : la moitié des cellules environ arrivent à séparer leurs chromatides sœurs lors d’un traitement de 5 heures au nocodazole, contre 80% des cellules chez le mutant mad1 et 10% chez la souche sauvage (Kitazono et al., 2003). D’autres études montrent également que l’activité Cdk est nécessaire au bon fonctionnement du checkpoint du fuseau chez S. pombe et chez les eucaryotes supérieurs (D'Angiolella et al., 2003; Yamaguchi et al., 2003).

Il est donc possible que l’ajout de l’analogue de l’ATP dans les expériences de la figure n°M3 affaiblisse l’activité du checkpoint du fuseau et entraîne ainsi indirectement une perte de la phosphorylation de Rad53 induite par le nocodazole. Pour interprêter plus précisément ces résultats, il faudrait examiner le blocage du cycle des cellules cdc28-as lors du traitement au nocodazole en analysant par exemple l’abondance de Pds1.

Influence de l’inhibition de Cdc28 sur la phosphorylation de Rad53 induite par le nocodazole.

La souche L197 (W303 cdc28-as) est synchronisée à l’"-facteur, puis relarguée dans un milieu contenant du nocodazole. On ajoute de l’inhibiteur 1-NAPP1 (10 µM final) dans certaines cultures aux temps indiqués sur le schéma (A). Des aliquots sont prélevés à la fin de chaque expérience représentée sur le schéma (A) et analysés par Western-Blot (B) avec un anticorps dirigé contre la protéine Rad53 et par FACS (C).

Résultats et Discussion – Checkpoints de l’ADN et checkpoint du fuseau

2.2.3. Influence de Glc7, Ptc2 et Ptc3 sur la phosphorylation de Rad53 induite par le nocodazole

Au laboratoire, il a été mis en évidence que les phosphatases Ptc2 et Ptc3 étaient nécessaires à la déphosphorylation de Rad53 après une cassure double-brin de l’ADN, que ce soit au cours d’un processus de rétablissement ou d’un processus d’adaptation (Leroy et al., 2003). Ptc2 et Ptc3 sont également nécessaires à la déphosphorylation de Rad53 observée après un traitement à la camptothécine (cf figure n°G9D).

La surexpression de GLC7 à l’aide d’un plasmide centromérique accélère la déphosphorylation de Rad53 lors du processus d’adaptation après une cassure HO chez les mutants ptc2! et ptc2! ptc3! (cf figure n°G5). Elle accélère également la déphosphorylation de

Rad53 chez le mutant ptc2! ptc3! après un traitement à la camptothécine (cf figure n°G9E). De

plus, l’extinction de l’expression de GLC7 semble engendrer le maintien de la phosphorylation de Rad53 induite par une cassure double-brin irréparable chez la souche sauvage (cf figure n°G8).

Ainsi, Ptc2, Ptc3 et Glc7 semblent être capables d’influer sur l’état de phosphorylation de Rad53 en cas de dommages de l’ADN. C’est pourquoi nous avons cherché à mettre en évidence un effet potentiel de ces phosphatases sur la phosphorylation de Rad53 engendrée par l’activation du checkpoint du fuseau. Des expériences préliminaires semblent indiquer que la surexpression de GLC7, à l’aide d’un plasmide centromérique ou d’un plasmide multi-copie, n’a pas d’influence sur la phosphorylation de Rad53 lors d’un traitement au nocodazole. Il en est de même pour la surexpression de PTC2 (plasmide multi-copie) (données non montrées). Pour confirmer cela, il faudrait toutefois étudier la cinétique d’apparition du doublet lors de l’ajout de nocodazole sur une population de cellules synchronisées portant ces vecteurs et/ou la cinétique de disparition du doublet lorsque ces cellules sont remises dans un milieu sans drogue après un blocage au nocodazole. Toutefois, nous avons montré que la cinétique de disparition du doublet n’était pas altérée chez le double mutant ptc2! ptc3! (cf figure n°4A). Les premiers tests

semblent donc indiquer que les phosphatases Ptc2, Ptc3 et Glc7 ne sont pas capables de modifier la phosphorylation de Rad53 en cas de dommages du fuseau.

2.3. Quelles peuvent être les significations physiologiques des