Nous avons décidé de tester l’effet de différents métabolites, puisque l’état nutritionnel de B.
pertussis affecte l’activité de BvgAS (Nakamura et al., 2006). Ainsi, nous pouvons imaginer
que la fixation d’un ligand abondant dans le cytoplasme, lorsque la bactérie est dans un bon état nutritionnel, lui permet la production, coûteuse en énergie, des facteurs de virulence. Dans un environnement carencé, ce métabolite serait moins abondant, et sa faible concentration défavoriserait la fixation sur le domaine PAS, rendant BvgS moins actif ou totalement inactif et permettant ainsi à la bactérie d’utiliser ses ressources pour s’adapter à ce stress.
Un grand nombre de molécules a été testé, et les résultats les plus probants sont présentés ci- dessous (Fig. 99 et 100). Plusieurs composés stabilisent la protéine recombinante. Les molécules induisant une déstabilisation de la protéine ne sont pas représentées.
Figure 99 : Stabilisation thermique du domaine PAS par des ligands potentiels. Les carrés bleus et violets correspondent respectivement au Tm obtenu avec la concentration maximale de composés (33 mM) ou avec la concentration minimale nécessaire pour une stabilisation supérieure à 2°C. Cette concentration est notée entre parenthèses pour chaque composé.
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Ainsi, deux familles de composés ‘stabilisants’ ont été déterminées et sont présentées dans la figure 100. Acide oxaloacétique Inosine 5’monophosphate Acide malonique Uridine 5’ monophosphate
Figure 100: Classification en deux familles des molécules permettant une stabilisation de la protéine PAS recombinante.
L’acide oxaloacétique et l’acide malonique sont liés au cycle de Krebs : le premier est un intermédiaire et le second un inhibiteur compétitif de la succinate déshydrogénase. Ces deux molécules sont très semblables, ainsi il est possible que seul l’acide oxaloacétique soit un ligand potentiel pour le domaine PAS. Une diminution de la concentration de cette molécule dans le cytoplasme de B. pertussis reflèterait un moins bon état métabolique et le domaine PAS non ligandé serait alors moins stable et pourrait conduire à la perte d’activité de la kinase. L’inosine est impliquée dans la biosynthèse des purines, et l’uridine dans celle des pyrimidines. Les concentrations des composés utilisés sont relativement élevées, mais de l’ordre de celles retrouvées dans le cytoplasme d’E. coli (Bennett et al., 2009).
Nous nous sommes ensuite demandé s’il n’y avait pas deux sites de fixation au niveau du domaine PAS, étant donné que les molécules trouvées peuvent être classées en deux groupes. Des mutations avaient été introduites dans la cavité putative du domaine PAS en se basant sur un modèle obtenu in silico (Dupré et al., 2013). Ces protéines N2C3 mutantes ont été testées en TSA avec l’ajout des molécules d’intérêt (acide oxaloacétique, inosine, inosine 5’ monophosphate, uridine, uridine 5’ monophosphate, acide malonique et ammonium citrate tribasique). Ces mutants ont les phénotypes suivants : BvgSC607A et BvgSH643A sont insensibles au nicotinate ; BvgSR670A, moins sensible ; BvgSY596A+N631A ne présente pas d’activité kinase. Pour la protéine N2C3C607A, l’ajout d’inosine 5’ monophosphate ou d’acide malonique a un effet stabilisant seulement à de forte concentration (33 mM); les autres molécules sont sans effet. L’ajout des différentes molécules à la protéine N2C3R670A permet la stabilisation du domaine. Pour les protéines N2C3H643A et N2C3Y596A+N631A aucune augmentation de Tm n’est observable après l’ajout des molécules à différentes concentrations. Ces résultats laissent à penser que les ligands potentiels pourraient se fixer dans la cavité en interagissant avec certains de ces résidus. La combinaison de composés des deux familles différentes a un effet additif sur les Tm, ce qui pourrait impliquer des sites de fixation
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différents. Ne disposant pas de la structure du domaine PAS à cette époque, des analyses de docking n’ont pas été entreprises. Ces dernières pourraient apporter des informations sur le site de fixation potentiel de ces molécules, dans ou en dehors de la cavité, et sur les résidus qui pourraient être impliqués.
Deux types de métabolites stabilisent le domaine PAS de BvgS et pourraient se fixer dans sa cavité, supportant un lien entre métabolisme et virulence. Il s’agit de précurseurs d’acides nucléiques, ou d’acides carboxyliques impliqués dans le métabolisme énergétique. Des essais de cristallisation avec ces molécules stabilisatrices ont été infructueux. Ces recherches n’ont pour le moment pas été poursuivies étant donné la difficulté de tester l’effet d’une carence ou déplétion de ces molécules sur l’activité de BvgS. Toutefois, il serait intéressant d’utiliser des techniques plus sensibles comme l’ITC ou la thermophorèse pour confirmer la fixation et déterminer l’affinité des interactions.
Des molécules impliquées dans les mécanismes de transport d’électrons et d’oxydoréduction sont également capables de stabiliser la protéine N2C3. Il s’agit du NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) et du NADPH (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate) qui augmentent respectivement le Tm de 2,5 et 5°C lorsqu’ils sont ajoutés à 33 mM. Il serait intéressant de continuer les analyses de TSA en testant leur effet à plus faible concentration et avec les mutants de cavité du domaine PAS.
Les nombreuses autres molécules testées n’ont pas montré de stabilisation de la protéine recombinante. C’est le cas par exemple de différents sucres. Ces résultats sont en accord avec le fait que B. pertussis n’utilise pas de sucre comme source de carbone (Thalen et al., 1999). Au cours de la croissance bactérienne, la bactérie produit du β-hydroxy-butyrate qui peut s’accumuler sous forme de granules de stockage (Thalen et al., 1999). Ce composé ne semble pas constituer un ligand pour le domaine PAS.
D’autres tests de TSA pourraient également être réalisés en utilisant par exemple des lysats de bactéries à différents stades de croissance.
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