BvgS présente une activité kinase à l’état basal et suite à la perception de différentes concentrations de modulateur, une inactivation du senseur-kinase s’effectue grâce au passage en mode phosphatase. Aucune information n’était disponible quant à la transduction de signal par les connecteurs mécaniques en hélices α de BvgS, avant le démarrage de cette étude. Les analyses de cysteine scanning réalisées pour les derniers résidus périplasmiques de l’hélice H19 ont mis en évidence des contacts proches des hélices. Celles-ci seraient dynamiques, en accord avec l’idée que la dynamique du VFT1 est le moteur pour l’activité du système. Mes données suggèrent également que la dernière portion de l’hélice périplasmique de BvgS serait légèrement déroulée/étendue, ce qui serait en accord avec notre idée de levier et d’un mouvement de piston symétrique. En effet, si les domaines VFT s’appuient sur la membrane et effectuent un mouvement de levier, celui-ci va ‘tirer’ sur le segment transmembranaire. Le fait que l’hélice périplasmique soit étendue agissant comme un linker souple pourrait en effet faciliter la remontée du segment membranaire tout en évitant une contrainte trop forte. Les résidus polaires du segment avant la membrane pourraient interagir avec les têtes polaires des lipides et réguler ainsi le mouvement de remontée.
Les analyses de cysteine scanning réalisées au niveau du segment transmembranaire de BvgS ont mis en évidence des contacts proches des hélices ainsi qu’une dynamique rotationnelle pour la première portion du segment transmembranaire. Pour le motif GxxxA qui est connu
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pour favoriser les contacts proches, relativement peu de formation de pont disulfure sont observables caractérisant ainsi un éloignement des hélices qui pourrait être dû à un point de pivot et un mouvement de cisaillement. Dans la membrane, les profils de dimérisation à l’état basal et suite à la perception de modulateur sont semblables. Des résultats similaires ont été obtenus pour DcuS (partie V.B.1.a.), pour les chimiorécepteurs à l’aspartate et au ribose/galactose, et pour EnvZ (Heininger et al., 2016), et dans ces cas des mouvements de piston avaient été proposés. Des analyses d’accessibilité des cystéines réalisées chez E. coli ne nous ont pas permis jusqu’ici de confirmer l’hypothèse d’un mouvement de piston symétrique en réponse au modulateur. La composition et l’épaisseur de la membrane d’E. coli pourraient différer de celles de B. pertussis. Ceci est suggéré par un profil de formation de pont disulfure variable entre les deux bactéries pour la mutation periplasmique R539C, appuyant ainsi une différence d’environnement. Des analyses d’accessibilité de cystéine seront effectuées in vivo chez B. pertussis. Des analyses in vitro après reconstitution de BvgS en vésicules pourraient également être envisagées, mais à l’heure actuelle, nous n’arrivons pas à produire la protéine en quantité suffisante. Si nous y parvenons, nous pourrions tester l’hypothèse de piston grâce à des analyses de RPE, comme décrit pour le chimiorécepteur Tar (Ottemann et al., 1999) ou des marquages fluorescents pour étudier l’accessibilité des cystéines membranaires. Si nous ne pouvons pas mettre en évidence de mouvement de piston symétrique, cela pourrait indiquer une amplification du signal au sein de la protéine, avec peu de changements au niveau du segment membranaire, et une augmentation de l’amplitude de mouvement plus bas (écartement des hélices précédant le domaine PAS et rigidification du coiled coil précédant la kinase). En effet, de faibles variations dans le profil de formation de pont disulfure sont observables au centre du segment membranaire (motif GxxxA) et pourraient s’apparenter à un rapprochement des hélices ; ce léger changement de conformation pourrait être suffisant pour transmettre l’information au domaine en aval si un phénomène d’amplification a lieu au sein du senseur-kinase. Il faut noter également que tous les résidus de la membrane n’ont pas été ciblés et il n’est pas exclu que des modifications plus drastiques soient observables pour les quelques positions non testées.
Dans la famille de BvgS, le coiled coil reliant le segment membranaire au domaine PAS présente une variété de tailles mais pas par multiples d’heptades. Ainsi, on peut se demander quels seraient les mouvements de ce coiled coil pour permettre la transduction de signal. Les analyses de cysteine scanning ont montré une dynamique rotationnelle du linker à l’état basal et un mouvement d’écartement des hélices pour le passage en mode phosphatase. La taille et la composition du linker sont critiques pour l’activité et la régulation de BvgS, ceci est illustré par les nombreuses mutations dans cette région qui rendent BvgS insensible aux modulateurs. Les analyses de cysteine scanning réalisées au niveau du domaine PAS ont mis en évidence un changement d’interface suite à la perception de modulateur. Une faible proportion de dimère était observable pour la grande majorité des positions testées à l’état basal, pouvant s’expliquer par une certaine flexibilité de ce domaine. Des expériences préliminaires de RMN sur le domaine PAS recombinant avaient montré sa grande mobilité qui pourrait être nécessaire pour l’activité kinase. L’ajout de modulateur diminue la formation de dimère pour la majorité des positions testées. Différents mouvements peuvent alors être proposés comme
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une dé-dimérisation du domaine, ou des mouvements de rotation couplés ou non à des mouvements de cisaillement. Une dé-dimérisation du domaine pourrait être en accord avec le mouvement d’écartement des hélices en amont. La structure cristallographique du domaine PAS obtenue récemment montre un agencement entre monomères non physiologique, ce qui n’est pas inédit pour ce type de domaine. En effet, différentes structures de domaine PAS ont déjà été référencées comme étant ‘aberrantes’ avec des domaines en tête bèche ou présentant une interface de dimérisation très étendue/éloignée où les résidus des feuillets β ne présentent pas d’interaction. Sur base de la structure du domaine PAS de BvgS, il sera difficile de choisir des résidus potentiellement en interaction pour continuer notre analyse de topologie par cysteine scanning. De la dynamique moléculaire où des contraintes seront imposées pour favoriser un rapprochement des feuillets β pourrait permettre de reconstruire un modèle de dimère plus plausible et aider aux choix des résidus à cibler.
Les analyses réalisées au niveau du coiled coil reliant le domaine PAS à la kinase ont mis en évidence l’importance d’une balance entre rigidité et dynamique pour l’activité basale et la réponse à la modulation de BvgS. A l’état basal, le coiled coil présente une forte dynamique rotationnelle favorisant l’autophosphorylation de la kinase et est en accord avec les modèles de régulation proposés dans la littérature (modèle de flip-flop, partie II.A.3.b.1.). La perception de modulateur permet la rigidification du coiled coil, induisant le passage en mode phosphatase.
Au vu des résultats obtenus, il semblerait que BvgS soit dynamique à l’état basal. Différents degrés de dynamique doivent exister au sein de la protéine pour permettre une signalisation par modules comme précédemment décrit pour les chimiorécepteurs Tar et Aer (partie V.F.). Trois phases de virulence, Bvg+, Bvgi et Bvg- ont été référencées (voir partie II.B.2.d.). Nous avons caractérisé la topologie et la dynamique de BvgS à l’état basal (phase de virulence, Bvg+) et après la perception de modulateur (phase d’avirulence, Bvg-). La phase Bvgi caractérisée par une faible activité de BvgS pourrait correspondre à une dynamique intermédiaire ou à un déplacement de l’équilibre entre les deux états déjà présentés. Ainsi, BvgS pourrait être caractérisé par trois ou deux états de signalisation.
Les chimères dépourvues de domaine PAS ont permis de mettre en évidence que les règles de régulation de BvgS pouvaient s’appliquer à la famille. Ainsi, la composition du coiled coil précédant la kinase est importante pour la capacité du senseur-kinase à passer d’un état d’activité à un autre. La kinase serait régulée par un changement de dynamique du coiled coil. Avec les coiled coils de petite taille insérés entre les domaines VFT et la kinase de BvgS, la perception de modulateur chimique n’est pas un signal assez fort pour permettre le changement d’état, comparé à la fermeture du VFT1, laissant à penser qu’in vivo la perception d’un ligand par ce domaine régulerait l’activité de la kinase. Un mécanisme de transmission d’information peut être proposé pour les chimères de BvgS et celui-ci pourrait être applicable à la famille. A l’état basal kinase, le senseur-kinase est caractérisé par une dynamique globale, des domaines périplasmiques et du coiled coil précédant la kinase qui serait sujet à des mouvements de rotation. La perception de modulateur (ou la fermeture du VFT1) génère un mouvement de piston symétrique des segments transmembranaires et un écartement des hélices en aval des domaines périplasmiques. Un point de pivot dans le coiled coil permettrait
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des contacts proches des hélices au niveau du motif LLAAA, laissant le coiled coil adopter son interface hydrophobe caractéristique de l’état phosphatase. Deux registres de coiled coil ont pu être identifiés pour la majorité des linkers des homologues de BvgS dépourvus de domaine PAS. Une inter-conversion entre ces deux registres permettrait la régulation de ces senseurs-kinases. L’état kinase serait caractérisé par un coiled coil stable en partie N- terminale et dynamique en partie C-terminale. L’état phosphatase quant à lui serait caractérisé par un coiled coil dynamique en partie N-terminale avec des mouvements d’écartement possibles, et la partie C-terminale du coiled coil serait stable, permettant sa rigidification. La composition des différents linkers pourrait faire intervenir des altérations de la périodicité comme des stutters, stammers ou skips (voir partie V.A.3), qui interviennent dans la régulation. Pour les homologues dépourvus d’un motif LLAAA discernable, il se pourrait alors que les règles de régulation diffèrent quelque peu de celles énoncées ci-dessus. Dans toutes nos chimères, nous avons conservé le segment membranaire de BvgS, mais il est vraisemblable que dans les protéines d’origine, le segment transmembranaire ait évolué pour s’adapter à la composition membranaire de l’organisme hôte, ce qui pourrait altérer un peu la dynamique et le mode de transmission de l’information.