Le coiled coil reliant le domaine PAS à la kinase va avoir un impact direct pour la régulation de l’activité de BvgS suite à la perception du modulateur par les VFT et la transmission du signal par le domaine PAS. Différents travaux ont été menés pour étudier la topologie et la dynamique du linker et ainsi pouvoir déterminer les règles pour la régulation de BvgS. Les résultats obtenus ont été valorisés par une publication d’article dans le journal mBio (Lesne et al., 2016) et seront présentés ci-dessous dans leur version originale et grâce à un résumé.
1. Balance between coiled coil stability and dynamics regulates activity of BvgS sensor-kinase in Bordetella
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2. Résumé
Les figures citées dans ce résumé correspondent à celles du papier ci-dessus.
Le coiled coil reliant le domaine PAS au domaine DHp de la kinase est composé de trois heptades présentant des résidus leucines et alanines au niveau de cinq des six positions centrales du coiled coil (‘a’ et ‘d’) définissant un motif ‘LxxxLxxAxxxAxxA’ (Fig. 1). Différentes insertions et délétions ont été réalisées en se basant sur les travaux de Möglich et al. (2009) afin de déterminer comment le registre du coiled coil influence la régulation de la kinase. L’insertion de 1, 4 et 7 résidus ou la délétion de 7 résidus ont le même effet et inactivent BvgS (Fig. 2). Grâce à des alignements de séquence d’homologues de BvgS présentant deux domaines VFT, nous avons pu mettre en évidence que la taille du linker de BvgS (21 résidus) était conservée dans 96% des séquences d’homologues contenant un domaine PAS. Il semblerait également que la composition de cette région soit conservée dans la famille (Fig. 3). La taille ainsi que l’interface des hélices semblent importantes pour l’activité de BvgS, supportant un rôle mécanique pour ce linker.
Des analyses de ‘cysteine scanning’ ont été entreprises pour étudier la topologie et la dynamique du linker. Pour ce faire, une protéine tronquée présentant les domaines VFT jusqu’à la kinase et avec une étiquette de six histidines ajoutée en partie C-terminale de la protéine pour faciliter sa détection, a été produite chez E. coli (protéine dénommée BvgSt). Notons que les deux cystéines natives du domaine PAS et du site catalytique de la kinase ont été substituées, ce qui n’affecte pas l’activité de base de BvgS mais diminue sa sensibilité aux modulateurs chimiques. Un modulateur plus efficace, le chloronicotinate, a donc été utilisé pour permettre le passage en mode phosphatase. Les mutations ont également été introduites chez B. pertussis (la protéine sous sa forme complète mais modifiée est appelée BvgSfl) pour déterminer l’activité des différents variants obtenus (Fig. S2). Un traitement oxydant à l’aide de cuivre o-phenanthroline a été réalisé pour favoriser la formation de pont disulfure intra- dimère de BvgSt dans le cytoplasme d’E. coli. A l’état basal, la formation de pont disulfure est observée pour toutes les positions testées, dans des proportions différentes. Ainsi, une proportion plus importante de dimère est observable pour les substitutions en cystéine aux positions ‘a’ et ‘d’ du coiled coil, mais également au niveau des positions flanquant ces résidus (Fig. 4). Ces résultats indiquent qu’à l’état kinase, le coiled coil est fortement dynamique. La topologie et la dynamique du linker ont également été étudiées en condition phosphatase après l’ajout de chloronicotinate 30 minutes avant oxydation. Les résultats obtenus montrent que pour les positions ‘a’ et ‘d’ du coiled coil, une augmentation de la production de dimère est observable. Une diminution de la formation de pont disulfure est visible pour les autres positions du coiled coil. L’état phosphatase de BvgS semble caractériser par un coiled coil plus rigide entre le domaine PAS et la kinase, adoptant son interface hydrophobe centrée sur les positions ‘a’ et ‘d’.
Le motif LLAAA semble jouer un rôle important dans la régulation de l’activité de BvgS. Ainsi, des modifications de ce dernier ont été entreprises dans le but de renforcer ou déforcer le coiled coil. Les trois alanines ont été successivement remplacées par des leucines pour obtenir un leucine zipper, et les deux leucines ont été remplacées par des alanines afin d’affaiblir l’interface hydrophobe (Fig. 5). Des calculs de l’énergie d’interaction au sein de
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chaque coiled coil ont été réalisés et montrent que l’introduction de leucines permet la stabilisation du coiled coil (Fig. 5B). Le remplacement des leucines par des alanines, permet quant à lui l’obtention de valeurs plus élevées de pseudo-énergie d’interaction par résidu, indiquant une déstabilisation du coiled coil. Ces différents remplacements ont également été effectués in vivo chez B. pertussis. Le remplacement de la première alanine du motif par une leucine donne un mutant actif et davantage sensible à la modulation que la souche sauvage tandis que les remplacements de 2 ou 3 alanines du motif par des leucines, mènent à l’inactivation de BvgS. Ainsi, le remplacement de la première alanine par une leucine va induire un coiled coil plus stable que celui de la protéine sauvage, ce qui va favoriser le passage en mode phosphatase en nécessitant une plus faible concentration de modulateur. La stabilisation trop importante du coiled coil (avec le remplacement de 2 ou 3 alanines) empêche la kinase d’adopter sa conformation active. Le remplacement des leucines par des alanines permet quant à lui l’obtention de mutants actifs mais insensibles à la modulation. Le coiled coil ainsi généré semble trop déstabilisé pour adopter la conformation correspondant à l’activité phosphatase.
Au sein de la famille de BvgS, 35% des senseurs-kinases ne possèdent pas de domaine PAS et présentent à la place, des hélices α s’étendant de la membrane jusqu’au domaine DHp de la kinase (Fig. 3). Ces dernières présentent des tailles variées et portent généralement le motif LLAAA. Pour déterminer le rôle du domaine PAS dans la signalisation, nous avons procédé à la délétion de ce dernier sur base d’un homologue dépourvu de domaine PAS. Trois délétions ont alors été réalisées et diffèrent chacune d’un résidu pour reconnecter les hélices flanquantes de manière fonctionnelle. Aucun variant obtenu n’a présenté d’activité kinase (Fig. S4). Ces résultats suggèrent que les régions en amont et aval du domaine PAS n’ont pas évolué pour fonctionner ensemble en absence de domaine PAS. Nous avons alors décidé de changer d’approche en remplaçant la portion entre le segment transmembranaire de BvgS et le domaine kinase par des séquences provenant d’homologues dépourvus de domaine PAS et présentant des tailles différentes. Toutes les chimères obtenues sont dotées d’une activité kinase (Fig. 6). La sensibilité au modulateur dépend notamment de la taille du linker, ainsi les chimères présentant un linker de grande taille entre la membrane et le DHp, sont sensibles au modulateur, alors que les plus petites ne le sont pas. Les deux chimères sensibles au modulateur (BvgSΔPAS-R3 et BvgSΔPAS-R4) présentent une énergie d’interaction par résidu considérablement plus faible que les autres chimères (BvgSΔPAS-R1 et BvgSΔPAS-R2, non sensibles au modulateur et présentant un linker de plus petite taille), indiquant ainsi que les linkers des deux longues chimères adoptent plus facilement une conformation stable du coiled coil (Fig. S5).
Etant donné que le motif LLAAA est également retrouvé dans les séquences de nos chimères sans PAS, des modifications de celui-ci ont été entreprises dans la chimère de plus petite taille, qui est insensible au modulateur (BvgSΔPAS-R1). Le renforcement du coiled coil par la substitution de la première alanine du motif par une leucine permet de restaurer la sensibilité au modulateur (Fig. 7). Le remplacement successif des autres alanines permet d’obtenir des mutants inactifs. Ainsi, la stabilité du coiled coil favorise le passage en mode phosphatase. Les mêmes règles de régulation de la kinase sont observables avec et sans domaine PAS. Il est
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probable que les homologues de BvgS dépourvus de domaine PAS régulent leur activité kinase par la fermeture de leur domaine VFT. Nous avons ainsi voulu tester cette hypothèse en induisant la fermeture du VFT1 de BvgS par l’introduction d’un pont disulfure pour deux de nos chimères, BvgSΔPAS-R1 et BvgSΔPAS-R1-1L, respectivement insensible et sensible au modulateur. La fermeture du VFT1 affecte l’activité du variant R1 et abolit totalement celle du variant R1-1L (Fig.7). La fermeture des domaines VFT par un pont disulfure, mimant la fixation d’un ligand antagoniste, permet le passage en mode phosphatase même pour les linkers de petite taille. Il s’agit donc d’un signal plus fort que celui donné par le nicotinate. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence que la taille et l’interface du coiled coil entre le domaine PAS et la kinase sont critiques pour l’activité de BvgS. L’état kinase serait favorisé par un coiled coil dynamique, tandis que l’état phosphatase serait permis lorsque le coiled coil adopte une conformation plus rigide centrée sur son interface hydrophobe. Cette balance entre rigidité et dynamique s’applique également en absence de domaine PAS et semble en accord avec les récents travaux impliquant un mécanisme de flip-flop pour la régulation de la kinase (Mechaly et al., 2014). Le domaine PAS de BvgS est dispensable pour l’activité kinase mais semble jouer un rôle amplificateur de signaux négatifs et faciliter la transition vers l’état phosphatase. Nous proposons un modèle dans lequel le domaine PAS pourrait présenter deux interfaces. A l’état kinase, l’interface de ce dernier empêcherait le coiled coil en dessous d’adopter son interface hydrophobe, ce qui induirait la dynamique du coiled coil. La perception du signal modulateur devrait modifier l’interface du domaine PAS, permettant ainsi au coiled coil en aval d’adopter une conformation rigide caractéristique de l’état phosphatase.
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B. Transmission d’information des domaines VFT jusqu’au domaine PAS