Organisation du connecteur mécanique

a. Description et caractéristiques

Les domaines périplasmiques sont reliés au domaine PAS par une longue hélice H19 qui s’étend à travers la membrane jusque dans le cytoplasme (Fig. 75).

A

B C

Figure 75 : Organisation du connecteur mécanique entre les domaines périplasmiques (VFT) et le domaine PAS cytoplasmique. A. Séquence protéique du connecteur. En bleu est colorée la séquence de la portion périplasmique de H19, en vert le segment membranaire prédit et en noir la jonction cytoplasmique. La prédiction de coiled coil est indiquée par les lettres ‘a’ et ‘d’. B. Répartition des résidus chargés dans la jonction entre la membrane et le domaine PAS. Les signes ‘+’ et ‘-’ sont utilisés pour illustrer les résidus chargés positivement ou négativement. C. Répartition des substitutions apparues de manière spontanée pour compenser des mutations au niveau des domaines VFT induisant l’inactivation de BvgS. Ces différentes mutations référencées induisent l’obtention de mutants actifs et insensibles à la modulation. Dans B et C, les résidus prédits pour adopter une position ‘a’ ou ‘d’ du coiled coil sont colorés en rouge.

Au niveau périplasmique, l’hélice H19 est constituée de 15 résidus. De manière générale, cette taille est conservée dans la famille de BvgS mais la composition en séquence semble relativement variable. Le segment membranaire prédit de BvgS est constitué d’un ensemble de 22 résidus principalement hydrophobes, mais comprenant également deux sérines et deux glycines. Un motif GxxxA connu pour favoriser les contacts proches entre les hélices transmembranaires est retrouvé mais ne semble pas conservé dans la famille de BvgS. En effet, un alignement de séquences de différents homologues de BvgS présentant deux domaines VFT et un domaine PAS a mis en évidence une conservation du caractère hydrophobe des résidus sans réelle conservation de séquence (Fig. 76). Rappelons qu’en général, les segments membranaires sont constitués de plus de 70% de résidus hydrophobes.

138

Figure 76 : Alignement de séquence d’homologues de BvgS présentant deux domaines VFT et un domaine PAS montrant la représentativité des résidus du segment membranaire grâce à la représentation WebLogo. Les segments transmembranaires ont été prédits par le logiciel Topcons 2 (http://topcons.cbr.su.se).

Au niveau cytoplasmique, les hélices sont constituées de 28 résidus prédits pour former un coiled coil (Fig. 75A). Une certaine diversité de taille est observable parmi les homologues de BvgS présentant deux domaines VFT et un domaine PAS (de 27 à 31 résidus, avec un petit nombre de cas à 20 ou 23 résidus). Un grand nombre de résidus chargés sont retrouvés (Fig. 75B) et semblent conservés dans cette sous-famille (Fig. 77). Grâce à l’alignement WebLogo des séquences de ces homologues de BvgS, présentant deux domaines VFT et un domaine PAS avec un motif d’entrée du domaine PAS ‘PxP’, nous pouvons observer la relativement grande conservation de séquence.

Figure 77 : Alignement de séquence d’homologues de BvgS présentant deux domaines VFT et un domaine PAS avec un motif d’entrée ‘PxP’ montrant la représentativité des résidus de la jonction entre la membrane et le domaine PAS, grâce à la représentation WebLogo.

De plus, la région cytoplasmique du connecteur est très particulière de par la grande quantité de mutations induisant une insensibilité à la modulation, qui sont apparues de manière spontanée pour compenser le phénotype inactif obtenu suite à l’introduction de mutations spécifiques dans la portion périplasmique de BvgS (Fig. 75C) (Miller et al., 1992; Goyard et al., 1994; Manetti et al., 1994; Uhl and Miller, 1996; Dupré E., Thèse de doctorat, 2013). L’analyse de séquences de BvgS provenant d’isolats de Bordetella a permis de mettre en évidence une grande conservation en acides aminés du connecteur reliant les domaines périplasmiques au domaine PAS (Herrou et al., 2009).

b. Importance de la taille de la jonction cytoplasmique pour l’activité de BvgS

Etant donné la grande diversité de taille observable dans la famille entre la membrane et le domaine PAS, même si la taille de 28 acides aminés correspondant à la taille du linker de BvgS semble la plus fréquente, nous avons voulu déterminer les conséquences sur l’activité de BvgS, d’un changement de taille de ce linker. Pour ce faire, nous avons procédé au remplacement de la jonction entre la membrane et le domaine PAS par celle provenant

139

d’homologues de BvgS présentant des tailles différentes. Les différentes constructions ont été réalisées à partir de gènes synthétiques (Genecust, Luxembourg) qui codent le segment membranaire de BvgS, la jonction provenant de l’homologue et le début du domaine PAS de BvgS (Fig. 78). Un clonage dans le vecteur intermédiaire pUC19mpla a été réalisé avec le couple d’enzymes de restriction BglII et Kpn2I. La suite du protocole expérimental est la même que celle décrite dans (Lesne et al., 2016). Ces expérimentations ont été réalisées par Mlle Maryem Ben Aissa, étudiante en dernière année d’école d’ingénieur, que j’ai encadrée personnellement durant ma thèse. Ses travaux ont fait l’objet d’un mémoire de recherche et lui ont permis l’obtention de son diplôme de fin d’étude.

A

B

Souches Charges pos. Charges nég.

BvgS 8 4

BvgS27AA 10 5

BvgS29AA 9 5

BvgS30AA 5 1

BvgS31AA 8 4

Figure 78 : Effet sur l’activité de BvgS de la longueur du segment entre la membrane et le domaine PAS. A. Alignement de séquences des différentes chimères de BvgS construites de telle sorte à conserver le segment transmembranaire (TM) de BvgS ainsi que le domaine PAS. Le coiled coil de 28 acides aminés (28 AA) a été remplacé par celui provenant des homologues de BvgS indiqués à gauche dans l’alignement : Pni pour Pseudomonas nitroreducens (GI 516088738), Pdi pour Pantoea dispersa (GI 545152798), Psp pour

Pseudomonas sp. CF161 (GI 520812285) et Pag pour Pseudomonas agarici (GI 984943149). Les résidus conservés entre ces séquences

sont surlignés en bleu et jaune. B. Détermination du nombre de résidus chargés positivement (pos.) et négativement (nég.) pour les différents variants.

La composition des différents linkers choisis est semblable à celle du linker natif de BvgS, avec la présence de certains résidus très conservés (Fig. 78A). De plus, une même proportion de résidus chargés est observable entre les séquences, excepté pour le mutant BvgS30AA qui est moins chargé (Fig. 78B). La séquence native du linker cytoplasmique de BvgS, précédant le domaine PAS, est composée de 28 résidus. L’ajout ou la délétion d’un acide aminé entrainerait une modification du registre de chacune des deux hélices du coiled coil de 100°. Ainsi, la délétion d’un résidu ou l’ajout de 1, 2 ou 3 résidus (correspondant aux mutants BvgS27AA, BvgS29AA, BvgS30AA et BvgS31AA) affecterait le registre des hélices et donc l’interface putative du coiled coil en le décalant respectivement de -100, +100, +200 et de - 60°.

Ces différentes constructions ont été introduites chez B. pertussis sous forme plasmidique et ont toutes donné des variants de BvgS inactifs (non montré). J’ai ensuite vérifié la production de BvgS sur des lysats de cultures bactériennes (Fig. 79). Les différents mutants semblent bien produits, écartant un défaut de repliement ou de stabilité dû aux mutations générées. Il faut noter que ces variants sont produits à partir de plasmides, ce qui pourrait expliquer leurs niveaux élevés de production.

140

Figure 79 : Détermination par immunodétection de la quantité de BvgS dans des extraits membranaires de B.

pertussis pour les différentes chimères où le coiled coil

entre la membrane et le domaine PAS a été substitué par ceux provenant d’homologues de BvgS et présentant une longueur variable. La forme monomèrique de BvgS (m) est indiquée. La souche ΔbvgA est prise comme contrôle pour montrer l’abondance de BvgS dans une souche avirulente. La souche sauvage (WT) est utilisée comme contrôle positif. Le contrôle de charge indiqué par un astérisque correspond à une protéine non identifiée de B.

pertussis reconnue de manière fortuite par les anticorps.

Lors de cette analyse, nous avons joué sur la composition et la taille du linker, tout en conservant la séquence du segment transmembranaire. Il est probable que ces deux paramètres soient importants pour l’activité de BvgS. Ces résultats suggèrent un rôle mécanique pour ce linker qui inclurait aussi le segment membranaire. Nous avons donc décidé de poursuivre nos investigations en étudiant le linker entre les domaines VFT jusqu’au domaine PAS dans sa globalité dans le but de déterminer les résidus importants pour l’activité et la réponse aux modulateurs ainsi que la topologie et la dynamique de ce segment en hélice α.