Au niveau de sa portion périplasmique, BvgS présente deux domaines VFT. Notons que des domaines VFT sont également retrouvés chez les eucaryotes où ils constituent des récepteurs impliqués dans différents mécanismes de régulation du système nerveux (partie III.B.5.). Les domaines périplasmiques de BvgS semblent requis pour l’activité du système et par conséquent pour la régulation de la virulence de B. pertussis.
Différentes études ont mis en évidence l’importance des mouvements de fermeture des domaines VFT des récepteurs eucaryotes pour la signalisation. Chez BvgS, l’activité kinase à l’état basal dépend de la dynamique du VFT distal à la membrane, le VFT1. En effet, sa fermeture par un pont disulfure a un effet drastique sur l’activité de BvgS. Dans la structure cristallographique de la portion périplasmique de BvgS, le VFT1 est en conformation ouverte avec une charnière dépourvue de structure secondaire, et le VFT2 est en conformation fermée avec une charnière rigide constituée de brins β. Les analyses de RPE ont mis en évidence un gradient de dynamique au sein de la portion périplasmique avec un lobe 1 du VFT1 très mobile, le lobe 2 du VFT1 présentant une dynamique intermédiaire et le lobe 1 du VFT2 avec une dynamique ralentie.
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L’effet du nicotinate sur la portion périplasmique de BvgS a été analysé. Le site précis ainsi que les résidus impliqués dans la fixation de ce modulateur sont jusqu’à ce jour inconnu, mais de nombreuses indications suggèrent qu’il se fixerait au niveau de la cavité du VFT2. L’ajout de nicotinate à des cristaux du domaine VFT2 pour obtenir la structure du complexe avait induit la cassure des cristaux, suggérant une modification de la conformation de la protéine. Les analyses d’interaction ligand-protéine (ITC et thermophorèse) ont permis de mettre en évidence la présence d’un site de fixation par monomère. La fixation de nicotinate induit une diminution de la dynamique du lobe 2 du VFT1, qui pourrait s’expliquer par la formation d’un bloc compact entre le VFT2 et le lobe 2 du VFT1. Ce dernier va imposer une force sur les hélices H19 pour permettre la transduction de signal et le passage vers le mode phosphatase au niveau de la région cytoplasmique de BvgS. Le domaine VFT1 serait le moteur du système tandis que le VFT2 jouerait le rôle d’un transmetteur et permettrait d’atténuer le signal suite à la perception de nicotinate.
Peu d’information sont disponibles quant aux mouvements induits par les domaines VFT pour permettre la transduction d’information aux modules en aval. Le mécanisme principalement décrit est celui faisant intervenir des mouvements de cisaillement comme nous l’avons vu dans la partie V.B.1.b., avec l’exemple des domaines périplasmiques du senseur-kinase BT4663 de B. thetaiotaomicron. Ce type de mouvement a également été référencé pour expliquer l’ouverture du canal ionique des iGluR. Dans ce modèle, la fixation de glutamate induit la fermeture du domaine VFT proche de la membrane ce qui va permettre l’élaboration de mouvements de cisaillement des segments transmembranaires et ainsi l’ouverture du canal ionique (Mayer, 2006). Mes analyses de cysteine scanning du segment précédant la membrane ne nous ont pas permis de mettre en évidence ce type de mouvement des hélices H19 dans leur portion périplasmique. De la dynamique moléculaire et des analyses de modes normaux ont été réalisées sur la structure cristallographique du dimère périplasmique de BvgS. Ces analyses ont permis d’identifier les principaux mouvements des domaines VFT (ouverture/fermeture/torsion) et ont suggéré des mouvements de piston ou de rotation des hélices H19. Toutefois, il faut rappeler que la structure cristallographique obtenue n’est pas soumise aux contraintes imposées par la membrane ni par le reste de la protéine, puisqu’il s’agit uniquement de la forme périplasmique soluble. Dans d’autres systèmes, des mouvements de rotation couplés (PhoQ) ou non (McpB) à des mouvements de cisaillement ainsi que des mouvements de piston (chimiorécepteurs, DcuS, CitA) ont été rapportés pour induire la transduction d’information entre les domaines périplasmiques et cytoplasmiques (voir partie V.B.1). Mes résultats de cysteine scanning suggèrent quant à eux, un mouvement de piston symétrique à travers la membrane. Les analyses d’accessibilité de cystéine devront être poursuivies pour tester cette hypothèse. Le domaine VFT2 présente des boucles riches en résidus polaires et chargés, potentiellement en contact avec la membrane plasmique. Ces boucles pourraient jouer un rôle dans la conformation de la protéine, dans la fixation d’ions, ou dans la transduction de signal. Les domaines VFT2 pourraient s’appuyer sur la membrane pour permettre un mouvement de levier pour la transduction d’information à travers H19 en induisant un mouvement de piston symétrique au niveau du segment transmembranaire.
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Le VFT1 pourrait être le site de fixation d’un ligand antagoniste permettant le passage en phase d’avirulence de la bactérie, puisque sa fermeture affecte drastiquement l’activité kinase. Une recherche de ligand a été entreprise grâce à l’utilisation d’une souche à régulation inversée (peu active à l’état basal et qui nécessite la fixation de modulateur ou la fermeture du VFT1 pour son activation) portant un rapporteur fluorescent sous la dépendance de BvgS. Ainsi, l’activation de ce dernier se traduit par une apparition de fluorescence. Les différentes molécules identifiées se sont avérées relativement peu efficaces sur la modulation de l’activité de BvgS, soulignant le fait que s’il s’agit de ligand se fixant au niveau des domaines périplasmiques, leur efficacité est limitée. Il faudra poursuivre nos investigations, pour tenter de déterminer un ligand antagoniste pour le domaine VFT1 dont l’efficacité sera avérée, et qui permettrait le passage en mode phosphatase de B. pertussis. Si nous parvenons à déterminer ce ligand, celui-ci sera utilisé en routine au laboratoire pour poursuivre l’étude de la transduction d’information au sein de BvgS. Une recherche de ligands pourrait également être effectuée pour déterminer des ligands antagonistes plus affins que ceux déjà disponibles pour le domaine VFT2, ceci éviterait les problèmes de croissance bactérienne qui sont généralement rencontrés lorsque de fortes concentrations de modulateur sont ajoutées au milieu de culture. Des analyses de docking pourront être réalisées pour faire un tri dans les molécules à tester in vivo. Il se pourrait également que le domaine VFT1 ne fixe pas de ligand antagoniste, et qu’il permette uniquement de donner de la dynamique au système. Le VFT2 serait alors le domaine de régulation permettant la fixation des modulateurs, et agirait comme un frein pour diminuer la dynamique du système et induire le passage en mode phosphatase. Toutefois, la cavité du domaine VFT1 est bien conservée chez Bordetella ce qui laisse à penser qu’elle reste utile pour la fixation d’un ligand particulier.